[发明专利]凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种凡纳滨对虾EST‑STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。本发明利用从NCBI数据库获得的凡纳滨对虾EST序列，开发获得8个具有高度多态性的凡纳滨对虾EST‑STR标记，编号分别为Lv‑F2a、Lv‑F7a、Lv‑F8a、Lv‑F9a、Lv‑F30a、Lv‑F31a、Lv‑F36a和Lv‑F40a。本发明的凡纳滨对虾EST‑SSR标记可用于凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种，为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育奠定基础。

技术领域：

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)养殖业是我国水产养殖的支柱性产业，目前我国凡纳滨对虾养殖年产量超过100万吨，占养殖对虾总产量的80％。但由于目前我国引进和繁育的凡纳滨对虾大多是人工繁育群体，容易引起遗传衰退。因此，良种选育是保障我国凡纳滨对虾养殖业可持续发展的重要举措。近年来，以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术在水产育种中得到了广泛应用，加快了良种选育的进程。

微卫星(microsatellite)，又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)，是广泛分布于真核生物基因组，由2-6个核苷酸多次串联重复构成的长达十至几十个核苷酸的序列。由于微卫星标记具有杂合程度高、多态性丰富、重复性好、共显性遗传等优点，已广泛应用于群体遗传多样性研究、基因定位、遗传连锁图谱构建、种质鉴定和品种分类以及分子标记辅助育种中。随着功能基因组学的飞速发展，大量的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)数据为开发STR标记提供了便利条件。与传统的STR标记相比，EST-STR标记的开发更省时省力。同时，由于EST-STR标记反映的是转录区的差异，它的多态性可能与基因功能直接相关。因此，EST-STR标记在分子标记辅助选择育种领域的应用价值更高。迄今为止，凡纳滨对虾EST-STR标记的开发较少，因此，我们希望通过高度多态性EST-STR标记的开发为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育奠定基础。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。为凡纳滨对虾遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供高度多态性的分子标记。

为实现上述发明目的，本发明利用从NCBI数据库获得的凡纳滨对虾EST序列，开发凡纳滨对虾高度多态性EST-STR标记，并提供多态性引物，为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育提供高度多态性的分子标记。

本发明从NCBI的dbEST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.htm1)批量下载凡纳滨对虾的EST序列，并通过MISA软件进行微卫星位点查找，以二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸重复次数15次以上的序列为备选序列。采用PrimerPremier 5软件，共设计了40对引物，并利用这40对引物对凡纳滨对虾的基因组DNA进行PCR扩增，其中有8对引物能稳定扩增出目的条带。采用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper 3.2软件读取等位基因片段的长度，用Cervus 3.0软件对多态性信息进行分析，最终确定了8个具有高度多态性的凡纳滨对虾EST-STR标记。

本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾EST-STR标记，所述的EST-STR标记编号为Lv-F2a、Lv-F7a、Lv-F8a、Lv-F9a、Lv-F30a、Lv-F31a、Lv-F36a和Lv-F40a；

所述的Lv-F2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的Lv-F7a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；