[发明专利]一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法

说明书

本发明公开了一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法。步骤：用75%乙醇对取血部位进行消毒，用1 mL注射器抽取血淋巴，将血淋巴以1:1的体积比与ACD抗凝剂混合。用5μm孔径滤膜过滤去除血淋巴中的血细胞，将获得的滤液再过滤0.2μm孔径滤膜。用SYBR^®Green I荧光染液染色0.2μm孔径滤膜，然后对其制片后在荧光显微镜上进行观测。统计每个视野中的微生物数量，最后根据公式计算血淋巴中微生物的丰度。本发明方法可准确计数拟穴青蟹、凡纳滨对虾和葡萄牙牡蛎等无脊椎动物血淋巴中包括可培养微生物和未培养微生物在内的所有微生物，其计数结果比平板菌落计数法高约2个数量级，其变异系数也明显低于平板菌落计数法。本发明方法具有计数准确度高、抗干扰能力强、出结果快、应用广泛等优点。

技术领域

本发明涉及计数微生物丰度的方法，具体地说是一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法。

背景技术

拟穴青蟹（Scylla paramamosain，简称青蟹）是广盐广温性的海洋经济甲壳动物，它是我国青蟹属的优势种，其个体大、肉味甘美，营养与经济价值高。青蟹主要分布于广东、福建、浙江、广西和海南沿岸海域，是我国最重要的海水养殖蟹类之一（林琪等，2007），目前青蟹年产量超过14万吨、年产值愈100亿，在我国海水鱼类和海水甲壳动物养殖产量中位居第二（王桂忠等，2016）。

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）原产于太平洋西岸的拉丁美洲，其甲壳较薄，虾体呈青灰色或青蓝色。凡纳滨对虾食性广，环境适应能力强，能在温度13~40℃，盐度2-34的环境中存活（徐国方，2008）。凡纳滨对虾是我国养殖产量最大的虾类，2015 年我国凡纳滨对虾养殖产量占当年对虾总产量的 85.85%，达到162.524 万吨（2016年《渔业统计年鉴》）。

葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）属软体动物门（Mollusoa），双壳纲（Bivalvia），主要养殖在我国南方，喜好高温高盐环境（林清，2013）。牡蛎肉味鲜美，营养丰富，是目前我国乃至世界产量最大的经济贝类。2016 年《渔业统计年鉴》显示，牡蛎年产量为457.33万吨，在我国海水贝类养殖产量中位居第一。