[发明专利]一种止血蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种止血蛋白及其制备方法和应用，所述止血蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或插入且与止血功能相关的衍生氨基酸序列。上述止血蛋白的制备方法主要包括：目的基因的合成及扩增、构建重组表达载体、构建基因工程菌、诱导表达和HisFF亲和层析纯化。该止血蛋白中杂质少，不含有毒有害成分，避免了病毒感染、病毒传播、过敏等不良反应的产生。该方法操作简单，生产周期短，成本较低，具有良好的工业化生产基础和良好的市场前景。

技术领域

本发明基因重组表达技术领域，具体涉及一种止血蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

根据2007年卫生部统计，每年各类伤害发生约2亿人次，因战争、交通事故、重大自然灾害等伤害死亡人数约70~75万人，然而失血过多是导致创伤死亡的主要因素之一。在各类突发性事故中，导致伤者死亡的直接原因一般不是事故本身所造成的伤害，而是伤员没能得到及时的救治，特别是治疗前创伤出血没能得到有效的控制，最终因失血过多而导致死亡。因此，有效地控制血液流失是急救和创伤治疗的重要步骤，也是挽救生命的关键措施。

在救治过程中，使用优良的止血材料可显著减少创伤部位的出血量，为伤者的抢救和治疗赢得更多的时间，在一定程度上降低创伤死亡率。因此，研制可快速、有效地控制出血的止血材料具有重要的意义。近年来，随着材料科技的不断发展，以及人们对止血产品的认识和要求的提高，胶原蛋白、角蛋白类止血材料越来越受到人们的关注和青睐。然而，当前胶原蛋白、角蛋白类产品多为提取方式获得，多采用酸、碱、氧化、还原等破坏蛋白质结构的化学提取过程，提取物为断裂的多种蛋白片段复合物，已经丧失或部分丧失了原本的生物学活性，导致其质量、性能的不稳定，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。 随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种具有优异止血功能的止血基因、止血蛋白及其制备方法，为本领域开发优良性能的止血药品提供更好更多的选择；同时解决现有止血蛋白生物活性不高、质量和性能不稳定的问题。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种止血基因， 包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过一个或几个碱基的替换和/或缺失和/或插入且与编码止血功能相关的衍生多核苷酸序列。

进一步，本发明还提供一种止血蛋白，包括由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码得到SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或者如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或插入且与止血功能相关的衍生氨基酸序列。

本发明还提供一种融合表达载体，包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

进一步，本发明还提供一种止血蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）根据权利要求1所示的多核苷酸序列，合成目的基因，再通过PCR扩增，得到止血基因并命名为PRO-1；

2）构建含有止血基因PRO-1的重组表达载体；

3）将步骤2）构建好的重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

4）将步骤3）得到的大肠杆菌基因工程菌进行发酵培养至对数生长期；

5）发酵培养结束后，对大肠杆菌基因工程菌进行诱导和表达，即表达止血蛋白PRO-1；

6）将步骤5）表达的止血蛋白进行纯化，得到如SEQ ID NO.2所示的止血蛋白PRO-1。

另外，本发明还提供一种动物止血药物，其有效成分为上述的止血蛋白PRO-1。