[发明专利]北方根结线虫抗性鉴定方法

权利要求书

1.北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)无菌花生毛状根制备

选用粒大饱满的20个花生品种的种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；

(3)北方根结线虫的接种于培养

将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿上，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

调查记录有根结根数占整个根系的百分率。

2.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：

根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性，抗性分级标准:

免疫：无根结；

高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；

抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；

感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；

高感：有根结根数占整个根系的50％以上。

3.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：具体试验过程如下：

(1)无菌花生毛状根制备

选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min；在无菌条件下，用75％酒精浸泡花育45种子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒；其次用无菌水洗涤花育45种子3～4次，每次3-5min；最后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去花生种子的种皮，接种于无激素的MSB5培养基上；

在无菌条件下，接种环挑取于农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基中；其中，LB液体培养基中添加50mg/L Kan，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h；然后取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化，使其达到对数生长期；最后使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；

(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备

收集上述花生根结样品，将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物；

将混合物加入到1.0％NaClO溶液中，没过根系，混合3min；将含有NaClO溶液的混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目；

薄雾喷洒40目筛上的混合物，喷洒0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，至组合筛的底部；

取出组合筛中的325目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度；

取出组合筛中的500目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫卵悬液，离心，去除上清液，再加入200@10-6链霉素，继续离心，去除上清液，以上过程重复3次；倒去上清液,加入无菌水离心5min，以上过程重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部无菌线虫悬浮液；

(3)北方根结线虫的接种于培养

将上述根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿，盒盖静置1h，膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；

(4)抗性鉴定

将步骤(3)的花生毛状根漂洗干净，调查记录根结数量，计算供试群体根内有根结根数占整个根系的百分率。