[发明专利]一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用

说明书

一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用，根据EGFR基因序列，设计一对包括上游引物和下游引物的扩增引物，根据L858R(2573T>G,COSM6224)突变序列，设计检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针，采用上述引物和探针进行ddPCR，针对ctDNA中的肺癌靶向用药相关的重要位点进行检测分析，首先对肺癌患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中EGFR突变位点L858R的突变情况，并以此指导患者用药。可用于肿瘤的Ⅰ期、Ⅱ期、ⅢA期等早期肺癌诊断,可检测0.0625％EGFR基因L858R突变，灵敏度可达到常规方法的10倍以上。

技术领域

本发明一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用技术，属于医学和生物技术领域，涉及IPC分类中C12Q包含酶或微生物的测定或检验方法的改进技术，可用于指导肿瘤用药的基因检测，尤其是高灵敏度地检测外周血浆/血清中EGFR基因L858R位点突变，以及进一步根据检测结果来指导对于具有EGFR L858R位点突变的肺癌患者对表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物的用药。

背景技术

由于肿瘤组织取样难度大，血液检测EGFR基因突变将成为筛选表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)适治患者的重要补充或者替代选择。但是血液检测的应用存在巨大挑战，原因在于血液检测本身存在检测物质含量低，特别是早期肿瘤病人血液中检测物质含量更是少之又少。血液检测用于诊断非小细胞肺癌(NSCLC)能否实现与检测技术的发展和进步密不可分。目前已有很多血液检测的方法报道，如HRM法、Arms-qPCR法、CAST-PCR法等，但这些方法检测EGFR敏感型基因突变的敏感度和特异性均有待提高，因而这些方法应用于血液检测、特别是早期癌症血液检测的可靠性和准确性仍存在质疑。

对于发生EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者，应用表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物治疗非常有效，例如吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)和达沙替尼(dasatinib)。因此，检测EGFR基因是否突变成为肺癌病人是否使用EGFR靶向药物的前提条件，这也已经在非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测技术领域形成中国专家共识。

尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是EGFR突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆或血清中的游离核酸cfDNA(Circulating free DNA),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化，但是应用cfDNA检测准确并特异地检测EGFR突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低，而其中肿瘤来源的游离核酸ctDNA(Circulating tumor DNA)质量更是参差不齐、含量高低不一。不仅如此，EGFR检测方法特异性有待提高。使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％，因此需要高灵敏度和高特异性检测EGFR突变的方法。

应用血浆/血清ctDNA检测EGFR突变，目前检测方法主要有：

1)高分辨率熔解曲线(HRM)。HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术，检测敏感度在1％-10％左右，然而，由于染料法假阳性高，后期需要测序验证，导致检测周期较长。

2)探针扩增阻滞突变法(ARMS-qPCR)。专利号CN104099422A公开相应技术，包括利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，该检测方法的灵敏度高于HRM，约为1％。