[发明专利]一种通用型衣藻外源基因表达载体构建方法

说明书

本发明提供了一种用于表达衣藻外源基因的载体构建方法，该载体包含一个潮霉素B（Hygromycin B，Hyg⁺）筛选基因，一个外源基因插入位点，一个用于标记外源基因表达的标签3×HA，以及一个用于终止外源基因转录的终止子。该载体通过对已有载体pHyg3的序列改造获得，外源基因可通过限制性内切酶EcoRV或无缝克隆的方法连入，对于外源基因在衣藻细胞内表达具有很高的应用研究价值。

技术领域

本发明涉及一种在衣藻中进行外源基因表达并且具有检测标签3×HA的质粒构建方法，该通用型表达质粒经过进一步插入目标表达基因片段（含有目标基因的启动子，不含有目标基因的终止密码子），利用电击转化法可以将该表达质粒随机整合进入衣藻基因组中，进行3×HA标签目标蛋白的表达。

背景技术

绿色微藻是一类广泛分布，自养与异养相结合的微生物，其细胞代谢产物富含多种蛋白质、脂类、藻多糖、胡萝卜素、以及无机元素，在生物医药、食品保健、环境监测与净化、能源再生方面有广大的应用前景。其中，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种真核单细胞绿色微藻，除了具有以上的优点之外，还因为其生长周期快而且容易在实验室进行培养，细胞内的代谢与调控机制与高等动植物相似，以及其单倍性基因组已被阐明的原因，成为了目前研究植物光合作用，动物纤毛调控，以及新陈代谢机制等的模式生物之一。

在进行衣藻细胞内生理过程的机制研究中，常采用正向遗传学手段，进行随机的插入突变研究表型与基因的关联性，当获取了表型与基因的关联性之后，需要进行该突变体目标基因互补实验，进一步验证基因与表型的关联性，并且通过目标基因的表达可以获得更多该基因的生物学信息。另外一方面，在以衣藻的某一蛋白为研究对象时，由于没有商业化的抗体可以进行免疫标记，因此采用通用型带有标签的衣藻表达质粒是一种替代方法，该表达载体可以用来表达感兴趣的蛋白，并且在C末端带有3×HA的标签，使用针对HA标签的一抗，可以进行免疫荧光、免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫电镜等等一系列实验。

因此该通用型衣藻外源基因表达载体，易于进行衣藻目标基因的表达与检测，获取目标蛋白的生物学信息。

发明内容

本发明是提出一种通用型衣藻外源基因表达载体构建方法，易于进行突变体互补实验与外源标签蛋白的表达，从而进一步获取更多的目标基因的生物学信息。

本发明的技术方案是这样实现的：

a) 克隆插入片段：设计用于无缝克隆的一对引物SI-pHyg3-HA-F和SI-pHyg3-HA-R，从pMCAK_HAedN_aphVIII质粒克隆约400bp的片段，该片段包括3×HA标签，终止密码子TAG，转录终止子rbcS2。1%琼脂糖凝胶电泳分离后使用胶回收纯化试剂盒回收，测定浓度后备用；

b)pHyg3载体制备：pHyg3质粒使用限制性内切酶EcoRV酶切以后，产生单一片段，全长4376bp，然后进行去磷酸化处理，检测浓度后备用；

c) pHyg3-HA载体构建：使用无缝克隆试剂盒将插入片段与载体连接，形成pHyg3-HA质粒，全长4777bp，采用热激转化法将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态中；

d) pHyg3-HA质粒的验证：上述体系构建成pHyg3-HA质粒（4.8 kb），仍具备EcoRV单酶切的基因插入位点，用菌落PCR方法检测是否正向的插入3×HA -rbcS2片段，使用引物pHyg3-HA-F和pHyg3-R1，约500bp。将菌落PCR的阳性克隆，过夜摇床恢复培养，提取质粒后，测序验证插入序列的正确性。