[发明专利]一种萃仙菇杂交育种方法

权利要求书

1.一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将白玉菇菌株与灰蟹菇菌株分别培养得到对应的适龄菌丝；

（2）原生质体的制备与再生：无菌条件下，将步骤（1）所得适龄菌丝分别进行溶壁酶酶解处理，得到原生质体，纯化，加入原生质体再生培养液，封口培养；

（3）挑取再生原生质体的尖端菌丝进行培养，并在无菌条件下筛选单核再生菌株，然后将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，接种培养，纯化，即得。

2.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（1）的培养方法为：先接种至试管斜面PDA培养基，25℃恒温培养10天，然后转接到平板PDA培养基，25℃恒温培养5～7天，再转接到250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温摇床上震荡培养4天，最后用无菌枪头吸取5mL新鲜幼嫩培养液到另一个250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温培养4天。

3.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（2）中，溶壁酶酶解处理的具体方法是：无菌条件下，将适龄菌丝倒入离心管中，离心处理，洗涤；用无菌滤纸吸干菌丝水分，然后取菌丝置于另一离心管中，加入溶壁酶溶液，30℃水浴，脱壁2.5小时。

4.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（2）中，纯化方法是：原生质体离心，除去上清酶液，再次离心，稳渗剂溶液洗涤，第三次离心去除稳渗剂与酶液，采用原生质体再生培养液洗涤，吸除上清液。

5.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（2）中，加入原生质体再生培养液 5mL，颠倒数次后混匀，静置1小时，待菌丝沉淀后，取上清液到离心管中，加入原生质体再生培养液 5mL，稀释后镜检，当原生质体的含量调整至每个低倍镜视野下只有1～2个原生质体的浓度时，吸取100μL的原生质体悬浮液涂布于原生质体再生培养基平板中，封口膜封口后，25℃恒温培养8～12天。

6.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法如下：

（31）观察原生质体再生的萌发情况，当出现芒状再生菌落的时候，挑取再生原生质体的尖端菌丝至试管斜面PDA培养基中进行培养；

（32）在无菌条件下，吸取5～10μL的乳酸石炭酸棉蓝染色液于载玻片上，挑取步骤（31）中培养好的菌丝置于所述染色液中，盖上盖玻片，染色1分钟，橡胶塞压平，制片在显微镜下镜检，以是否存在锁状联合为单核再生菌株的筛选标准；

（33）无菌条件下，将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，挑取其单核菌株菌块接种到试管斜面PDA培养基上，两菌块间间隔距离为1cm，25℃恒温培养；

（34）当两菌丝交联在一起时，挑取交联的菌丝于载玻片的乳酸石炭酸棉蓝染色液中，盖上盖玻片，染色1分钟，橡胶塞压平，在显微镜视野下镜检，以是否存在锁状联合为判断标准；若发现有锁状联合的菌株，挑取交联菌丝转接到试管斜面PDA培养基中，25℃恒温培养，即得纯化的杂交菌株；

（35）杂交菌株验证：进行拮抗反应实验和出菇试验验证杂交种与亲本菌株的形状差异。