[发明专利]一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2N突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的2S突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的3N突变脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的3S突变脂肪酶。本发明是以S8‑214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8‑214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8‑214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键，实现二硫键突变的组合优化；其中，在不同区域中/间组合二硫键效果更优。获得的突变脂肪酶的热稳定性强，特别适合在工业上应用。

技术领域

本发明属于酶工程领域，特别涉及一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其 制备方法与应用。

背景技术

耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是一种优良的脂肪酶，对中长链脂肪酸甘油 三酯(C12～C16)具有较高催化活性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品 加工、生物能源、化学合成以及胰腺缺乏症的治疗等多个领域，应用前景广泛。 但该脂肪酶在高温下迅速失活，在工业生产中损失较大，因此改善其热稳定性 对拓宽其实际应用具有十分重要的意义。

二硫键是蛋白质中唯一的共价键，约需要209.3～418.6kJ/mol的能量才能将 其打断，对维持蛋白质的结构和功能具有关键的作用。二硫键增强蛋白质的结 构稳定性表现在减少其构象熵，及增加其解折叠自由能，提高热力学稳定性。 同时，其效应还与提高蛋白质的动力学稳定性有关。二硫键能使肽链不同区域 的氨基酸残基聚集靠拢，形成高密度的氨基酸残基稳定结构。当围绕二硫键的 残基为疏水氨基酸时，则形成局部的疏水中心，减少水分子的进入，防止氢键 被破坏，保持高级结构的稳定。在蛋白质中构建二硫键是提高其稳定性的主要 策略之一，已经成功地应用于多种脂肪酶，如圆弧青霉低温脂肪酶，南极假丝 酵母脂肪酶和华根霉脂肪酶等。本实验室前期研究已筛选出能提高Lip2耐热性 能的单对二硫键突变位点，S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和 S118-177。

二硫键的正确形成是蛋白质折叠的限速步骤之一，控制引入的二硫键数目 非常必要。因此，在引入一定数目的二硫键时，合理地进行组合才能最大限度 地提高酶分子的热稳定性能，但目前并欠缺对二硫键组合方式和组合效果的探 讨。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，有针对性地进行了二 硫键突变的组合优化，并提供4种组合二硫键的耐热突变脂肪酶。

本发明的另一目的在于提供所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方 法。

本发明的又一目的在于提供所述组合二硫键的耐热突变脂肪酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶， 是以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域 间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时 引入1对或2对效果提升较强的二硫键；

所述的S8-214脂肪酶为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2二硫键突变体S8-214，具 体为：在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域(耶氏 解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列)引入二硫键突变，其制备 方法参考中国专利申请201610279266.3“一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应 用”。

所述的区域为β折叠头部区域，盖子1区域和β折叠尾部区域；其中，所述的 β折叠头部区域为S8-214脂肪酶的第32位到第82位氨基酸序列；所述的盖子1区域 为S8-214脂肪酶的第83位到第136位氨基酸序列；所述的β折叠尾部区域为S8-214 脂肪酶的第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸；