[发明专利]一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法

权利要求书

1.一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，其特征在于：首先采用短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶对蛋白质的疏水性区域进行高效酶解，然后采用液相色谱-质谱分析技术对酶解产生的多肽进行高通量分离和序列测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

(1)将蛋白质分散在变性缓冲液中，pH为5～9；蛋白质浓度保持在0.01～10mg/mL之间；

(2)在上述步骤(1)得到的蛋白质溶液体系中加入二硫苏糖醇，终浓度为5～40mM，在25～100℃孵育5～120min，再加入碘代乙酰胺，终浓度为10～80mM，20～37℃避光孵育20～40min，打开二硫键；

(3)使用pH 5～9的缓冲溶液超滤置换上述步骤(2)中处理的蛋白质溶液体系，使Urea浓度低于2M；按蛋白和酶质量比为20～50：1加入短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶，20～60℃孵育120min至过夜，得到蛋白酶解液；

(4)将上述步骤(3)得到的蛋白酶解液通过SPE C18除盐柱除盐，得到无盐的蛋白酶解液，冻干，复溶在体积浓度为0.1～1％的甲酸中进行LC-MS/MS分析。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，其特征在于所述的短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶，其酶切位点主要为短链疏水性氨基酸残基的C端，包括丙氨酸(Alanine，A)、缬氨酸(Valine，V)、亮氨酸(Leucine，L)和异亮氨酸(Isoleucine，I)等，针对以上四种氨基酸的总酶切特异性高达90％以上。

4.根据权利要求2所述一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，其特征在于：所述步骤(1)变性缓冲液包含25～200mM三(羟甲基)氨基甲烷，10～200mM氯化钠，1～20mM的氯化钙。

5.根据权利要求2所述一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，其特征在于：所述步骤(3)缓冲溶液为：25～200mM Tris-HCl，10～200mM NaCl，1～20mM CaCl₂。