[发明专利]一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途

权利要求书

1.一种类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其特征是：它是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP-anti-EGFR-iRGD-DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：

所述融合蛋白基因序列如SEQ ID No：4所示。

2.一种制备权利要求1所述类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的方法，其特征是：包括如下步骤：

步骤1、类弹性蛋白基因的构建：

采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列，将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，用T4连接酶将单双酶切产物按3∶7的比例在16℃下连接过夜，取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证，重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列；

将基因合成的含类弹性蛋白基因的质粒用BglI和PflM双酶切，酶切体系为20μL：BglI酶1μL、PflM酶2μL、酶切缓冲液5μL和质粒43μL；酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段；

步骤2、含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建

利用合成的含Hind III和EcoR I酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因；PCR体系为50μL，其中：ddH₂O 22μL、模板1μL、P1 1μL、P2 1μL和Extaq酶25μL，PCR反应条件是：95℃5min、(95℃30s；55℃30s；72℃1min)×30个循环和72℃5min，4℃保持，将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段，将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用HindIII和EcoR I酶进行双酶切，然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒；

步骤3、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增

首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化；接着将5μL BglI和PflM双酶切的类弹性蛋白基因与5μL SfiI单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接；将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长；挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h；使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒；

步骤4、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达

将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性的TB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆转入5mL摇管中37℃，210rpm继续培养8-12小时，按1％的接种量将摇管中培养过夜的菌液接种到200mL摇瓶中，添加氨苄抗生素的条件下培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度是1mM的IPTG，37℃，210rpm诱导表达4h，8000g，4℃离心收菌；

步骤5、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯化

将步骤4得到的沉菌重悬在10mL结合缓冲液：500mM氯化钠，20mM PBS，pH＝7.4，5mM咪唑，在冰水浴中进行超声破碎，超声条件为400W，工作2s间歇5s，共超声30min；超声裂解物于4℃，12000g离心，去沉淀，取上清过0.22μm的滤膜两次，上AKTA Purifier900FPLC系统使用5mL His Trap柱纯化；洗脱缓冲液为500mM氯化钠，20mM PBS，pH＝7.4，800mM咪唑，洗脱条件是0-30％洗脱缓冲液，20个柱体积，线性洗脱，检测波长是紫外280nm，收集目的蛋白，透析除去咪唑等小分子，并置换于反应缓冲液中；

步骤6、2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物的制备

3.75g 2，2’-联吡啶二硫化物溶于10mL乙醇中，加入0.4mL的乙酸，剧烈搅拌使其溶解，得到溶液1，将0.9g的3-巯基丙酸溶解在5mL乙醇中，缓慢滴加入溶液1中，室温反应20h，旋蒸除去溶剂，粗产物溶解在少量二氯甲烷/乙醇的混合溶剂中，通过氧化铝柱子进行纯化，以含4％乙酸的二氯甲烷乙醇混合溶剂为洗脱剂进行产物洗脱；

步骤7、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的制备

将100mg 2-羧乙基-2’-吡啶基二硫化物溶于20mL无水二氯甲烷中，加入50mg二环己基碳二亚胺和60mg N-羟基琥珀酰亚胺，得到反应液1，冰水浴反应30min，将80mg肼基甲酸叔丁酯溶于5mL无水二氯甲烷中，加入到反应液1中，撤去冰水浴，室温反应过夜，待反应完成后，旋干溶剂，得到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的粗产物，过硅胶柱进行纯化，洗脱剂为1％甲醇-二氯甲烷；

步骤8、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的制备

将50mg盐酸阿霉素溶于20mL无水甲醇中，加入20mg的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼和少量的三氟乙酸，室温避光搅拌，反应过夜，反应完成后，将溶剂旋干，重溶于少量甲醇，在乙腈中沉淀，离心收集沉淀，真空烘箱干燥，即得产物3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素；

步骤9、类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的制备

将步骤5制备得到的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白置换到pH＝6.5的反应缓冲液中，取100mg NHS-PEG-MAL加入10mL融合蛋白水溶液中，4℃反应8h，通过凝胶色谱柱分离反应混合物，得到PEG修饰的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD，再将上述产物置换至pH＝7.2的缓冲液中，加入5mg步骤8得到的阿霉素衍生物和100μmol的TCEP，4℃反应过夜，超滤浓缩，使用凝胶渗透色谱分离纯化，得到产物类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体。