[发明专利]一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法

权利要求书

1.一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株构建：首先，合成特定的基因打靶片段；打靶片段的两端为70bp的基因组同源序列，中间是卡那霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物切胶回收得到50ng/μL的高浓度打靶片段；然后利用5mmol/L的 L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的CLM37大肠杆菌2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电感受态细胞；将所得高浓度的基因打靶片段用DpnI酶消化6小时以上，再次切胶回收，导入上述电转化感受态细胞之中后，在含5mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的菌株，并使用鉴定引物lpp - F ：5 ′- catctgcgaacgtaccgaccgcgtgatgaa - 3 ′lpp-R ：5 ′- atgccatacacactgccagcaggctttacg-3′，应用PCR法和测序法进行鉴定；确定基因区域发生替换突变后，再转化入pCP20质粒以去除卡那霉素抗性片段，即得到Lpp基因敲除的分泌型菌株W3110ΔWecAΔLpp；

（2）构建大肠杆菌质周腔中表达目的蛋白的载体，结合空肠弯曲杆菌N-糖基化机制，得到能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌：将表达载体pIG6-rFn3-Gly及来源于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的 N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl质粒电击共转化大肠杆菌菌株W3110ΔWecAΔLpp菌株，获得可胞外生产N-糖基化重组蛋白的大肠杆菌菌株；

（3）步骤（2）中获得的能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌在自动诱导培养基中诱导胞外生产N-糖基化重组蛋白rFn3-Gly；

（4）步骤（3）获得的重组蛋白纯化后即得N-糖基化重组蛋白。

2.如权利要求1所述的一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）是利用Red同源重组方法将大肠杆菌 K-12来源的W3110ΔWecA中的外膜脂蛋白Lpp基因敲除，构建大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株。

3.如权利要求1所述的一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（2）所述空肠弯曲杆菌N-糖基化机制是将来源于空肠弯曲菌中编码寡糖转移酶pglB基因、寡糖合成基因簇以及含有编码寡糖转移酶pglB识别序列的目的蛋白基因的质粒转入大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株中。

4.如权利要求1所述的一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）将转化子接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体培养基 ,每升培养基中含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉平板上，过夜24小时培养；筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的LB 液体培养基，过夜16小时培养；次日，以1:100接种到10mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6；然后，以 1:100接种到100mL含有氨苄青霉素和氯霉素自动诱导培养基中，在 25℃、200rpm条件诱导表达48小时；在此过程，含有pIG6-rFn3-Gly及pACYCpgl的大肠杆菌 W3110ΔWecAΔLpp菌株胞外生产N-糖基化重组蛋白rFn3-Gly；其中，每升自动诱导培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘油5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，磷酸氢二钠7.1g，磷酸二氢钾6.8g，硫酸铵3.3g，硫酸钠0.9g，七水硫酸镁 0.25g。