[发明专利]一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定

说明书

本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定。本发明的主要步骤如下：设计定量引物对lncRNAXLOC_2017489做组织表达谱分析，鉴定其在子宫内膜中特异高表达；克隆lncRNA 5，侧翼序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，构建其缺失重组质粒，转染细胞，检测每个缺失片段启动子活性；其中Q6启动子片段活性最高，次为Q3、Q4、Q7、Q8。本发明的高活性启动子片段的序列如SEQ ID NO:3，4，6，7和8所示。本发明为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化猪转基因表达的组织特异性和稳定性。

技术领域

本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定。

背景技术

我国是世界养猪大国，猪肉是我国人民的主要肉食来源。养猪业在我国畜牧业和农业经济中占有重要地位。繁殖是猪生产中最重要的经济性状之一。养猪生产中存在的繁殖效率低下是困扰和制约着我国养猪业健康发展关键因素之一，进而影响猪肉的有效供给，导致近年来猪肉价格波动，多次成为领涨CPI(Consumer Price Index)的重要因素。无论从经济方面考虑还是从环境方面考虑，研究母猪的高繁殖性能，在保证需求的同时，减少能繁母猪的饲养量，具有重要的理论和实践意义。

子宫内膜是人和动物雌性生殖器官的一部分，是人和动物胎儿或幼体生长发育的场所，是维持生理特征和生育功能的重要器官，在胎儿附植、妊娠的建立和维持过程中起着不可或缺的作用。子宫内膜具有高度的增殖活性，可在雌激素、孕激素和细胞因子等的作用下发生周期性的改变，表现为子宫内膜上皮细胞和基质细胞的增生和脱落等。同时，子宫内膜对胚胎的可容受状态又直接影响着母体对胎儿的识别、胚胎植入的成功等。然而它又极易受流产、感染、内分泌等多种因素的影响，导致子宫内膜的再生能力下降，容受性降低，严重影响繁殖力。

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是近年来发现的一类在生物体内普遍存在并在生命活动中行使重要功能的RNA分子，它不编码蛋白质，也不直接参与蛋白质的合成。ncRNA广泛存在于从低等到高等的多种生物中，种类繁多，主要包括：miRNA(microRNA)、piRNA、siRNA、lncRNA(long noncoding RNA)等。lncRNA是一类长度大于200个碱基，通常由聚合酶转录形成，缺少完整的开放阅读框，没有或很少有蛋白编码能力的RNA。哺乳动物基因组序列中4％～9％的序列产生的转录本是lncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1％)。作为分子生物学中的一个全新领域，lncRNA是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多个层面上发挥调控基因表达的作用。作为哺乳动物转录组的重要组成部分，lncRNA的功能还有待于进一步深入研究。起初lncRNA被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。但近年来越来越多的研究表明lncRNA和蛋白质同等重要，具有多种重要的调控功能，能参与到细胞增殖分化和个体发育等几乎所有重要生命功能调控途径中，包括核内运输、细胞周期调控、X染色体沉默、染色质修饰、基因组印记、基因重组、转录、剪切、mRNA降解和翻译等。RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的。启动子是影响转录复合物形成和转录起始的关键DNA序列，含有RNA转录的重要信息，转录的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi etal.Combinatorial control of gene expression.Nat Struct Mol Biol.2004,11:812-815；Kim et al.Direct isolation and identification of promoters in the humangenome.Genome Res.2005,15:830-839)。因此，分离克隆lncRNA的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其转录调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。另外，可利用组织特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，强化转基因表达的组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。

发明内容