[发明专利]柑橘过敏原Cit s 3.01抗原表达纯化、多克隆抗体制备及应用

说明书

本发明公开了柑橘过敏原Cit s 3.01抗原表达纯化、多克隆抗体制备及应用，并具体公开了一种密码子优化的芸香科植物过敏原Cit s 3.01基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。本发明通过优化Cit s 3.01基因原核表达序列，基因合成，构建过敏原Cit s 3.01的原核表达体系，利用已表达纯化的rCit s 3.01蛋白制备兔多克隆抗体Anti‑Cit s 3.01，对诸如柑橘果皮、果肉中过敏原Cit s 3.01含量进行检测，并可以利用光密度值衡量Western blot印迹强弱的方法评价诸如柑橘果实可食用部分过敏原Cit s 3.01潜在的致敏性。

技术领域

本发明属于植物分子生物学、免疫学和食品安全检测技术交叉领域，更具体地，涉及一种柑橘过敏原Cit s 3.01抗原表达纯化、多克隆抗体制备及应用，获得柑橘属过敏原Cit s 3.01抗原表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备方法及它们的应用，即过敏原Cit s 3.01基因原核表达载体构建、重组表达、蛋白纯化、质谱鉴定和多克隆抗体制备，以及它们在芸香科植物(尤其是柑橘属植物)中过敏原Cit s 3.01蛋白含量检测的应用。

背景技术

据不完全统计，我国对食物过敏的人群约4000～5000万人左右。食物过敏的症状一般是局部的口腔病理症状，除此之外，还有一些其他症状，例如肠胃症状(恶心、呕吐、腹泻、肠胃绞痛等)，皮肤症状(麻疹、皮炎、湿疹、血管神经性水肿、皮肤瘙痒等)，呼吸系统症状(鼻炎、哮喘、喉咙肿等)和心血管系统症状(过敏性休克等)[1]。对于患者而言，最好的医治方案是设法剔除饮食中的食物过敏原，或者完全避免会引起的食物过敏的种类，但在实际操作中存在很多困难，故而鉴定和选择一些不含过敏原或低致敏的食物给过敏患者是一种比较好的解决方案。

柑橘是一类深受人们喜爱的水果，被国内外认为是健康食品，含有丰富的营养物质。柑橘除了果肉具有重要的食用价值之外，果皮、叶片、花粉均具有食用价值。柑橘皮具有较高的加工价值，其不仅富含香精油、色素、果胶、橙皮甙、膳食纤维还可以利用其进行微生物发酵，如生产果醋、乳酸饮料、高蛋白饲料和栽培食用菌[2]。橘叶在中药中具有价高的利用价值，具有疏肝、行气、化痰、杀虫等功效[3]。橘花辛温，顺气宽膈，和胃去胀，止咳化痰，具有一定的药用价值，用柑橘花窨制的柑橘花茶亦具有保健功效[4]。这些柑橘加工品均具有特殊的功能，为人们提供丰富的营养。尽管食用柑橘对人体有诸多益处，仍有许多人对柑橘类食物过敏。有研究表明中国大连地区过敏性疾病患儿皮肤点刺实验(SPT)阳性的食入性过敏原中，柑橘过敏原阳性率7.4％[5]。在招募的对枯草热花粉过敏患者中，有39％的患者对柑橘类食物表现出交叉过敏症状，并且所有的患者的IgE介导免疫反应机制都通过SPT确认呈阳性[6]。此外，随着柑橘类水果日益丰富，柑橘过敏现象也逐渐为人们所关注。如何开展现有柑橘类水果中潜在致敏性的评价已成为食品安全领域的一个新兴的研究方向和内容。

据已有研究表明，Cit s 1、Cit s 2和Cit s 3是三种主要的柑橘过敏原[7-10]。Cit s 3是一种脂质转运蛋白，是泛过敏原家族的成员，是三种主要柑橘过敏原之一[9,10]。因此，检测柑橘中具有可食用价值部分(如果实、花、嫩叶等)中Cit s 3.01过敏原蛋白的含量，是评价其是否致敏的指标之一。目前国际上研究过敏原较少涉及到检测柑橘过敏原含量，缺乏一种直接检测过敏原Cit s 3.01蛋白含量的方法。相较于通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测Cit s 3.01基因mRNA水平的评价方法，通过蛋白质印迹法(Western Blot)直接检测过敏原Cit s 3.01更能反映柑橘类水果中天然过敏原的含量，可用于评价柑橘潜在致敏性。

参考文献：

[1]白清云.某些食物的过敏性问题.中国食物与营养,2005,7:54-55.

[2]乔海鸥,丁晓雯,张庆祝.柑橘皮的综合利用.浙江农业科学,2003,2(03):31-35.

[3]崔国静,刘芳,贺蔷.橘叶、橘络、橘核的性状与药用价值.首都医药,2013,05.