[发明专利]柑橘天然抑菌蛋白CsLTP1制备及其应用

说明书

本发明公开了柑橘天然抑菌蛋白CsLTP1制备及其应用，并具体公开了一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP1基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。本发明通过抑菌蛋白CsLTP1密码子优化，原核表达载体构建，rCsLTP1的重组表达、纯化及鉴定，得到的rCsLTP1蛋白具备较好的热稳定性、酸碱稳定性，而且在活体条件下，对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌具有明显的抑制效果，与现有技术相对，本发明中的植物源抑菌蛋白CsLTP1是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于柑橘采后绿霉病防治领域，更具体地，涉及一种柑橘天然抑菌蛋白CsLTP1制备及其应用，可应用于防治芸香科植物果实(如柑橘)采后绿霉病，即利用基因工程制备柑橘天然抑菌蛋白CsLTP1的方法以及利用该方法制备的提取物作为植物源抑菌剂在诸如柑橘采后病害绿霉病防治中的应用。

背景技术

柑橘是全球第一大水果，在其采收、运输及贮藏期间，因措施不当导致果实损伤，易遭受多种病原菌的侵染产生采后病害，导致果实腐烂变质，给柑橘产业带来巨大经济损失[1]。由指状青霉(Penicillium Digitatum)和意大利青霉(Penicillium Italicum)引起的柑橘绿霉病和青霉病是柑橘采后的两大主要病害，导致的腐烂率为70％～80％[2-3]，其中以指状青霉引起的腐烂尤为严重[4]。这种柑橘采后病害主要表现为，果实上病部先发软，呈水渍状，2-3天后产生白霉状物(病原菌的菌丝体)，后中央出现绿色粉状霉层(病原菌的子实体)，嗅之有闷人的芳香味，很快全果腐烂，果肉发苦，不堪食用。目前控制柑橘采后病害及贮藏保鲜的方法主要是采用化学杀菌剂(如苯并咪唑类、咪唑类、抑霉唑、双胍盐类等)结合物理贮藏技术(如低温、热处理等)处理果实[5]。虽然化学杀菌剂对柑橘采后病害有一定的控制作用，但其毒性大、环境污染严重，给人类健康带来严重威胁，许多化学杀菌剂的使用在很多国家遭到限制。而且由于这些药剂长期使用使致病菌产生抗药性，导致采后病害控制方法更加复杂化，影响保鲜效果。因此，寻找一种具有抑制柑橘病原菌活性的植物天然活性物质来控制柑橘采后病害对柑橘产业的发展具有重大意义。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)因具有广谱的抗细菌活性，高效的抗真菌、病毒和原虫的活性；热稳定性好；抗菌机理独特，不易产生抗药性等特性，正引起人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。研究发现抗菌肽广泛存在于原核生物、植物及动物体内，并在生物的天然防御系统中起着重要的作用。抗菌肽包括抗细菌多肽(antibacterial peptides)和抗真菌多肽(antifungal peptides)[6]。目前，国内对植物源抗菌肽的研究相对较少。有研究报道非特异性脂质转运蛋白(Non-specific lipidtransfer protein,nsLTP)具备广泛的抗真菌功能[7]。但未见直接采用非特异性脂质转运蛋白这类抗菌肽作为植物源抑菌剂在果蔬采后病害防控方面的研发应用报道。参考文献：

[1]Brown G E,Chambers M.Evaluation of biological products for thecontrol of postharvest diseases of Florida citrus[C]//Proc.Fla.StateHort.Soc.1996,109:278-282.

[2]Demirci F.Effects of'Pseudomonas fluorescens'and'Candida famata'onBlue Mould of Citrus Caused by'Penicillium Italicum'[J].Australian Journal ofCrop Science,2011,5(3):344.

[3]何天富.柑橘学[M].北京:中国农业出版社,1997:714-734.