[发明专利]一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种茶叶热稳定性蛋白，其特征在于：所述茶叶热稳定性蛋白为水溶性蛋白，N-端一级结构序列为GDESPETL；所述蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

1）茶叶热稳定性蛋白粗提液的制备：以料液质量比1:3将茶叶鲜叶加入4℃预冷的含0.05M pH 7.2 Tris-盐酸缓冲液、10wt.%PVPP、5M尿素、1mM PMSF、1mM EDTA、5wt.% NaHSO₃的水溶液，冰浴上研磨，4℃浆液浸提3h，纱布过滤，滤过液4℃12000rpm离心30min，取上清，得鲜叶蛋白粗提液；

2）茶叶热稳定性蛋白的离子交换色谱分离：将10mL茶叶热稳定性蛋白初提液流加至以含5M尿素的0.02 mol/L、pH9.0Tris-盐酸缓冲液平衡的UNO Q阴离子色谱柱，以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.65mol/L NaCl、5M尿素的0.02 mol/L、pH9.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱100 mL，最后用含0.65 mol/L NaCl 、5M尿素的0.02 mol/L、pH9.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

3）茶叶热稳定性蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的茶叶热稳定性蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该茶叶热稳定性蛋白的等电点，以Edman degradation测定该茶叶热稳定性蛋白的N-端一级结构序列。

2.根据权利要求1所述的一种茶叶热稳定性蛋白，其特征在于：所述的茶叶热稳定性蛋白分子量为66.0kDa、等电点为4.82。

3.一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒，其特征在于：茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒由权利要求1中所述茶叶热稳定性蛋白组成，15个茶叶热稳定性蛋白单体形成一个球体的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为75±1.3 nm，表面电荷呈负性，范围在-24.7±0.6mV。

4.一种如权利要求3所述的一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的制备方法包括：将该茶叶热稳定性蛋白配制为0.11mg/mL的pH 5.05盐溶液，经过30℃加热30min，利用分子截留量为100 kDa的超滤离心管进行超滤去除未反应的茶叶热稳定性蛋白，即获得茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液。