[发明专利]一种用于黄曲霉毒素B1的可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料和分子生物学领域，用于食品安全的检测。

背景技术

黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物，主要分为黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂以及另外两种代谢产物M₁、M₂，其中黄曲霉毒素B₁的毒性最强，对人和动物具有急慢性毒性、致突变性、致癌性和致畸性，其代谢主要发生在肝脏，因此对肝脏的损害很大。黄曲霉毒素易溶于多种有机溶剂，如氯仿、甲醇、乙醇、丙醇、一二甲酰胺等，难溶于水，不溶于石油醚、乙醚和己烷。黄曲霉毒素B₁污染的食物范围很广，主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮食作物，我国南方地区受污染最为严重，主要是由于处于高温、高湿的环境。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，故一般烹调加工温度下难以破坏，为保证人们的食品安全，我国食品安全标准中规定：玉米及其制品、花生及其制品、花生油、玉米油中黄曲霉毒素不得大于20μg/kg；大米、其它食用油不得大于10μg/kg；其它粮食、豆类及其制品、其他熟制坚果、调味品不得大于5μg/kg；特殊膳食食品(如婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品等)不得大于0.5μg/kg。

目前，用于检测黄曲霉毒素B₁的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA)，这些方法各有其优缺点，TLC法需要的设备简单，但是检测灵敏度低；HPLC法灵敏度高、特异性强等优点，但是需要在液相色谱分离前进行复杂的预处理，不适合大批量样品的检测且仪器设备价格昂贵；ELISA法具有特异性强、分析时间短等优点，但稳定性较差，准确性不高。因此，发明一种操作简单、成本低、特异性强、灵敏度高、检测时间短的黄曲霉毒素B₁检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于黄曲霉毒素B₁的可视化检测方法，通过适配体修饰纳米金形成探针进行捕获黄曲霉毒素B₁，并结合纳米金的光学特性进行比色，故可实现快速地可视化检测黄曲霉毒素B₁，故本发明方法具有操作简单、成本低、特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点。

为解决以上技术问题，本发明一种用于黄曲霉毒素B₁的可视化检测方法，包括：

A、将巯基化黄曲霉毒素B₁适配体DNA₁和巯基化适配体的互补链DNA₂分别与13±2nm纳米金连接形成适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针；

B、通过竞争法进行黄曲霉毒素B₁的可视化检测，将适配体-纳米金探针、互补链-纳米金探针和待测物进行混合：

当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金容易发生聚集，颜色由红色变成蓝色；

当待测物中不含靶标时，适配体与其互补链碱基互补配对结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈稳定的网络结构，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色；

C、随着B步骤中靶标浓度的增大，纳米金颜色由红色逐渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800nm的紫外-可见光谱，即可实现对待测物中黄曲霉毒素B₁的定量检测。

黄曲霉毒素B₁适配体的互补链DNA₂的序列为：

5'SH-TTCACGGTAGCACGCATAGGTGGGGGCAGCTAAAGTCTCC-3'。

步骤A中制备适配体-纳米金探针时，NaCl陈化浓度为200mmol/L，制备互补链-纳米金时，NaCl陈化浓度为100mmol/L。

步骤A中巯基化黄曲霉毒素B₁适配体与纳米金偶联形成识别捕获探针，巯基化黄曲霉毒素B₁适配体的互补链与纳米金偶联形成信号探针，适配体-纳米金探针与互补链-纳米金探针的体积比为1:1。

B步骤中，适配体-纳米金探针、互补链-纳米金探针和待测物混合后加入NaCl溶液，该NaCl溶液浓度为400mmol/L。

具体地，所述的纳米金的制备方法步骤如下：

(1)将所用容器用王水浸泡约8h；