[发明专利]一种TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种TCR敲除的靶向的TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，包括：通过敲除T淋巴细胞上的TCR基因，并制备靶向TIPE3的T细胞受体，得到TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞。所述TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞可以有效防止T细胞中内源性和外源性的TCR的α链和β链间的错配，避免了自身免疫反应，保持高效且特异性的杀伤TIPE3阳性癌细胞的性能。本发明还提供了TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞的应用。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样3(TNFAIP8L3，TIPE3)是TNFAIP3家族成员，其作为脂类第二信使传输蛋白来促进癌变，作为反馈强化子在调控着癌变以及磷脂通路。TIPE3mRNA在很多组织中可以被检出，但是TIPE3蛋白在正常组织中表达很少，而在癌变组织中有很明显的表达抬升。因此，TIPE3是一个非常适合用于细胞免疫治疗中的肿瘤特异性靶点。

近些年来，免疫细胞治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后在恶性肿瘤治疗中具有巨大前景的一种治疗方法。T细胞受体(T cell receptor，TCR)基因修饰T细胞技术(TCR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。然而有研究表明，通过TCR-T技术转导的TCR与T细胞内源的TCR的亚基(例如α链与β链)之间存在错配，造成产生的错配的TCR的靶向识别能力丧失或识别自身抗原或者主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)而引起自身免疫反应。同时，获取到对肿瘤抗原高特异的、高亲和性的TCR基因，以及TCR的亚基间的正确配对仍面临着巨大挑战。目前还未有靶向TIPE3的T细胞受体同时避免TCR-T技术转导的TCR与T细胞内源的TCR的亚基之间错配的和研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞，所述TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞敲除了TCR基因，有利于防止T细胞中的内源性和外源性的TCR的α链和β链间的错配，保持高效且特异性的杀伤癌细胞的性能，并且对正常细胞不会造成损伤，避免了自身免疫反应。

第一方面，本发明提供了一种TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，包括：

(1)提供CD3阳性T淋巴细胞，敲除所述CD3阳性T淋巴细胞的TCR基因，得到TCR敲除的CD3阳性T淋巴细胞；

(2)提供靶向TIPE3的T细胞受体TCR-TIPE3的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的α链的编码基因、2A肽的编码基因和β链的编码基因，其中，所述α链的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述β链的编码基因包括编码如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述2A肽的编码基因包括编码如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)将所述TCR-TIPE3的编码基因插入到pLenti载体中，得到pLenti-TCR-TIPE3重组质粒；

(4)包装所述pLenti-TCR-TIPE3重组质粒，得到重组慢病毒；

(5)将所述重组慢病毒转染所述TCR敲除的CD3阳性T淋巴细胞，得到TCR敲除的靶向TIPE3的T细胞受体基因修饰T细胞。

可选的，步骤(1)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。

可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。