[发明专利]一种敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将嵌合抗原受体CAR‑ROR1的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到靶向ROR1嵌合抗原受体T细胞。所述敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是最为严重危害人类健康的疾病，每年中国大约三百万人被诊断为新发肿瘤患者，二百万人死于癌症。最近的研究显示，酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(Receptortyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)在多种B细胞恶性肿瘤上被表达的，并且随后在包括套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌和卵巢癌亚组在内的许多癌症的表面上鉴定了ROR1。此外，ROR1会在癌症干细胞如卵巢癌干细胞上高表达，并介导其迁移和侵袭。因此，ROR1是一种肿瘤特异性高，并在各类肿瘤中具有广谱表达的较为理想的肿瘤靶抗原。

嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。但是，CART技术目前的应用还局限于血液瘤，还未有对肺癌等多数实体瘤的相关研究。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。目前还未有敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞，所述敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性识别表面具有ROR1蛋白的肿瘤细胞，并激活T细胞的免疫作用对ROR1阳性肿瘤细胞进行杀伤，具有更加持久细胞活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供嵌合抗原受体CAR-ROR1的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向ROR1的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向ROR1的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-ROR1的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-ROR1重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-ROR1重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受体T细胞。

可选的，所述靶向ROR1的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。