[发明专利]一种基于CRISPR系统的基因组编辑方法及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR系统CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，包括以下步骤：

1)将1个或多个重复的tRNA-gRNA串联单元置于编码基因的内含子中获得inPTG内含子；

2)将获得的inPTG内含子与含Cas9核酸酶基因的外显子融合成一个inPTG-Cas9基因；

3)利用单个启动子来驱动inPTG-Cas9融合基因的表达，获得表达载体；

4)将含inPTG-Cas9融合基因表达元件的载体导入受体细胞进行转录表达，获得Cas9核酸酶和多个gRNA；

5)所述gRNA与Cas9核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。

2.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)中所述启动子为Pol II型启动子。

3.根据权利要求2所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述Pol II型启动子为UBI10启动子、PR5启动子或PR1启动子。

4.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述步骤4)中载体为pRGEB33载体，所述pRGEB33载体的内含子的序列如SEQ ID NO.7所示。

5.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述步骤4)中载体为pRGEB34载体，所述pRGEB34载体的内含子的序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求4或5所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述内含子中插入BsaI酶切位点用于PTG片段的克隆。

7.一种基于CRISPR系统CRISPR/Cpf1的基因组编辑方法，包括以下步骤：

1)将1个或多个重复的tRNA-crRNA串联单元置于编码基因的内含子中获得intron(PTC)内含子；

2)将获得的intron(PTC)内含子与含Cpf1核酸酶基因编码区的外显子融合形成一个intron(PTC)-Cpf1融合基因；

3)在所述intron(PTC)-Cpf1融合基因序列前添加启动子获得启动子-intron(PTC)-Cpf1融合基因序列；

4)将所述启动子-intron(PTC)-Cpf1融合基因置于载体中，导入受体细胞进行转录表达，获得Cpf1核酸酶和多个crRNA；

5)所述crRNA与Cpf1核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。

8.根据权利要求7所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述转录表达外显子的Cpf1核酸酶的过程中，利用剪接复合体剪切所述intron(PTC)-Cpf1融合基因中的包含tRNA-crRNA的内含子，然后利用tRNA加工系统切割其中的tRNA元件，释放多个crRNA。

9.根据权利要求7所述的基因组编辑方法，其特征在于，步骤1)中所述多个tRNA-crRNA串联单元替换为多个crRNA串联单元。

10.根据权利要求9所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述替换后利用表达的Cpf1蛋白切割crRNA串联单元，释放多个crRNA。

11.权利要求1～5、7～10任意一项所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述编辑包括为基因敲除、靶向基因激活/抑制、单碱基替换。