[发明专利]一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法

权利要求书

1.一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，所述葡萄糖氧化酶发酵用菌种为将葡萄糖氧化酶基因转入野生型毕赤酵母体内得到的重组毕赤酵母，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌种的富集培养：将重组的毕赤酵母依次接种于一级培养基和二级培养基中，进行菌种的富集；

2)将步骤1)所得发酵液置于经过灭菌处理的发酵罐营养液中；

3)建立OUR反馈调控发酵机制，包括：

(1)批发酵：将步骤1)中的菌种接入步骤2)的发酵罐中，进行发酵。初始发酵时，通过控制种子浓度及搅拌转速和风量控制毕赤酵母耗氧速率为0.4-0.7molO2/L/h；经过3-4h的适应期后，毕赤酵母开始呈指数生长，OUR值随之缓慢呈现平滑抛物线形式上升至35-45molO2/L/h，至发酵罐中甘油完全耗尽，此时OUR值下降为18-24molO2/L/h，得到初始发酵液。批发酵时间为18-23h；

(2)甘油补料：向步骤(1)所得初始发酵液中流加50％甘油和1.2％的PTM1混合液体，初始流加速率控制在18-19ml/L/h，使OUR值以平滑的抛物线上升至115-125molO2/L/h，至OD600＝300-400时，停止补料，此时OUR值为45-62molO2/L/h，得到二次发酵液；

(3)甲醇诱导：待步骤(2)中的二次发酵液温度降至室温，调节二次发酵液的pH值至4.5-5.5；饥饿培养菌种30-90min后，流加100％甲醇和1.2％的PTM1的混合液体，控制OUR值缓慢上升至180-220molO2/L/h，待OUR值开始下降时，结束发酵，得到发酵液；

4)将步骤(3)中所得发酵液离心，速率为12000rpm/min，时间2min，取上清液得到粗酶液；

5)将步骤4)中所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到葡萄糖氧化酶液体；

6)将步骤5)中所得葡萄糖氧化酶液体于-40—50℃环境中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶成品。

2.根据权利要求1所述的一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，其特征在于，所述耗氧速率计算采用舜宇恒平尾气质谱仪对进气和尾气进行实时在线采集分析。

3.根据权利要求1所述的一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中的一级培养基和二级培养基的组分均为酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。

4.根据权利要求1所述的一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，其特征在于，所述步骤2)中的发酵罐营养液的成分为：

甘油40g/L、硫酸铵10g/L、硫酸钙0.93g/L、硫酸钾18.2g/L、氢氧化钾4.13g/L、磷酸26.7ml/L、硫酸镁14.9g/L、PTM1 4.3ml/L和水1L。

5.根据权利要求4所述的一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，其特征在于，所述发酵罐营养液的制备方法为：

(1)称取、灭菌：将甘油40g、硫酸铵10g、硫酸钙0.93g、硫酸钾18.2g、氢氧化钾4.13g、磷酸26.7mL和水1L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；

(2)冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下下冷却至室温；

(3)混合：将14.9g的硫酸镁和4.3mL的PTM1单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。