[发明专利]基于马血清胆碱酯酶农残速测卡及其生产工艺和使用方法

说明书

一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡生产工艺，具体是利用盐析法将马血清中的胆碱酯酶析出、沉降，再经离心、复溶、透析步骤进行纯化，制得满足要求的胆碱酯酶，再根据所制备胆碱酯酶的活性，进行稀释，调节PH值、盐离子浓度，并加入稳定剂，制成农残速测卡酶工作液；将两个圆形滤纸片高温压合于一支持底板上，分别于两片滤纸片上滴加胆碱酯酶工作液、底物工作液，晾干后塑封，即制成农残速测卡。本发明制得的农残速测卡有较好的灵敏度、稳定性、重复性、再现性、简单、快速、直观、成本低，适用于瓜果蔬菜上农药残留的快速筛查。

技术领域

本发明涉及农产品农药残留检测技术领域，具体地说是一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡及其生产工艺和使用方法。

背景技术

农药作为一种重要的农业生产资料，对于防治病虫害、去除杂草、调节农作物生长具有重要作用。由于未按规定施药或对农药的潜在危害认识不足，造成农药直接或通过食物链间接富集于农副产品中或过量残留。全国每年都有上百起因食用被农药污染的农副产品而引起的急性中毒事件。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，长期危害的结果就是致畸、致癌、致突变及退发性神经系统中毒。控制农药残留，保护生态环境已成为环境保护的重要问题。因此，完善农药残留的检测手段和防控农药残留危害的工作刻不容缓。

目前对于农药残留的定量检测以气-质联用技术、液-质联用技术为主，但是这两项技术需要大型仪器和大型实验室、对检测人员和检测环境的要求都很高、步骤繁琐、成本高昂、不满足一线检测单位大批量和高效率农残检测的需求；也有人将免疫层析技术、酶联免疫检测技术应用于农药残留检测，但是由于残留的农药种类繁多、结构复杂，仅现在使用过的农药就有两千种之多，而且还不断有新的农药被研发使用，这两种只能检测某种或某几种农药残留的方法，无法适应庞杂的农药残留检测。

胆碱酯酶主要存在于昆虫的脑组织，脊椎动物的血液、肝脏及神经系统以及一些高等植物的种子中。有一些研究从昆虫(如果蝇)头部及各种鱼脑组织中提取ChE，但提取的ChE产量低、成本高、对农药残留检测的灵敏度低、专一性差等，以这些生物材料为基础提取胆碱酯酶，实用性不大、应用性不强。同时，也有一些文献报道了以马血清为原料提取胆碱酯酶的方法，但这些方法都过于复杂、成本高昂，如很多方法都用到了复杂的亲和层析法、凝胶过滤法等，这些方法所用到的填料价格很高、处理操作很费时，不利于大批量制备和产业化；此外，一些文献报道的分段盐析法提取的胆碱酯酶虽然纯度要高一些，但是回收率不是很高、而且获得的酶稳定性也不好。

而胆碱酯酶的底物有很多种，如乙酰胆碱、硫代乙酰胆碱、靛酚乙酸酯等。乙酰胆碱虽然是胆碱酯酶的天然底物，但该底物没有颜色、而且不易于诱发变色反应，所以对酶促反应结果不易于肉眼判定；硫代乙酰胆碱的酶促反应产物虽然可以诱发二硫代二硝基苯甲酸由无色变为黄色，但这一变色反应的肉眼区分度不高，尤其是以乳白色至浅黄色的酶片作为显色背景、更不易于辨识；而且二硫代二硝基苯甲酸作为显色剂的引入会使农残速测卡的操作更繁琐。传统制备靛酚乙酸酯的方法产率不高、终产物的杂质也比较多，改进工艺后产率可达 90％以上、杂质较少、易于纯化，且终产物的复溶液改进后使其更易于在滤纸片上扩散。

发明内容

为了解决上述技术缺陷，本发明提供一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡及其生产工艺和使用方法，具体是以马血清作为提取胆碱酯酶原料，并对马血清进行脱色处理后制备酶液、及后期的胆碱酯酶工作液后，即用于农残测速卡的制备。

本发明第一方面保护一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡生产工艺，包括如下步骤：

S1、胆碱酯酶底物的制备：将靛酚钠溶解到有机溶剂中，搅拌反应液至澄清，在20-50℃下反应1-5小时后干燥、复溶，即获得胆碱酯酶底物、备用；

优选地，步骤S1中，有机溶剂为乙酸酐与乙酰氯的混合液，且乙酸酐与乙酰氯的体积比为1:0.09～1:9；