[发明专利]黔北麻羊BMP4基因原核载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种黔北麻羊BMP4基因原核载体的构建方法。本发明能在构建黔北麻羊BMP4基因原核载体时，免除从组织中提取蛋白的繁琐步骤，简化操作。本发明通过简单的方法克隆黔北麻羊BM4基因并构建原核表达载体，表达纯化重组基因蛋白，通过多克隆抗体制备出BMP4基因的抗体，为黔北麻羊羊基因检测方法的建立提供基础,也为黔北麻羊多胎品系列的选育提供思路。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种黔北麻羊BMP4基因原核载体 的构建方法

背景技术

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)作为转化生长因 子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族中最大的一个亚家 族，具有多种生物活性(Wozney JM,Rosen V,Celeste AJ,et al.Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities.[J].Science, 1988,242(4885):1528-1534.)。

骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4，BMP4)作为BMPs 家族的成员，最先由Wozney克隆了其基因序列，称为BMP-2b，后 改名为BMP4(Suzuki A et al.,1997)。BMP4具有位置绝对保守的7 个半胱氨(Cys)残基，其中6个形成分子内二硫键，另一个形成分 子间二硫键借此连接两条多肽链形成的二聚体结构。在蛋白质合成后 期，BMP4氨基端前肽区被切去，形成具有活性的成熟肽，二聚体化 和分子成熟的过程可能发生于细胞内或分泌过程中(Sambrook J, Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratorymanual.[M]. Cold Spring Harbor Laboratory,1982.)。因此，只有形成二聚体形式的BMP4蛋白才有生物活性，才能启动细胞的信号传导。研究表明， BMP4可以促进软骨和骨组织的形成，在早期胚胎发育过程中，发挥 着信号分子作用(Shimasaki S,Moore R K,Otsuka F,et al.The bone morphogenetic protein system in mammalianreproduction.[J].Endocrine Reviews,2004,25(1):72.)。此外，BMP4在原始卵泡发育及向初级卵 泡的转化中发挥着促进作用(Novy R,Berg J,Yaeger Keith.pETTRX fusionsystemfor increased solubility of proteins)，表明BMP4在动物 生殖活动中也有着重要的作用。BMP4基因除参与机体的细胞生长、 分化、迁移、凋亡及细胞外基质形成等众多病理、生理活动的调控外， 在动物繁殖方面也发挥着越来越重要的作用。Shimaskai等(1999)报道BMP4和BMP7的mRNA主要存在于大鼠卵泡膜细胞，通过促 进FSH诱导雌二醇的合成，进而对孕酮的合成和分泌起抑制作用。 进一步的研究表明在BMP4抑制孕酮生成过程中，类固醇生成因子发 挥了关键的作用。Claire G等(2004)的研究表明BMP4能促进细胞 内卵泡抑素、雌二醇的基础分泌和胰岛素样生长因子的诱导分泌。此 外，还有研究表明BMP4可能参与了膜细胞向黄体细胞转化的 (Dooley C A,Attia G R,Rainey W E,et al.Bonemorphogenetic protein inhibits ovarian androgen production[J].Journal ofClinical Endocrinology&Metabolism,2000,85(9):3331-3337)。总体来说， BMP4可以通过发挥旁/自分泌调节的作用方式影响卵巢中卵泡的发 育和雌激素的分泌。目前检测黔北麻羊BMP4基因的方法主要有 RFLP和SSCP两种方法均费力,成本较高。

发明内容

本发明的目的是：提供一种黔北麻羊BMP4基因原核载体的构建方 法，它能免除从组织中提取蛋白的繁琐步骤，简化操作。