[发明专利]一种粗肋草组织培养快速繁殖方法

权利要求书

1.一种粗肋草组织培养快速繁殖方法,其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)预处理和外植体取材、消毒：选取性状优良、生长健壮的粗肋草栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期喷施杀菌药7天/次，喷施2次后可取材，从基部第二个芽上切下茎；用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20消毒18-22分钟；消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干，用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米，接种到诱导培养基；

(2)丛生芽的诱导：外植体接种入诱导培养基后放置于培养室，先暗培养7天后转光照培养，光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后可切下芽体转入增殖培养基扩繁；

(3)丛生侧芽增殖：将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基进行增殖培养；培养条件光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，培养45-50天后，即可获得增殖系数达2.5-3.5的丛生芽丛；将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光照度同增殖培养，以获得所需要的量产数量；

(4)无根芽体复壮培养：继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基，培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同增殖培养，培养35天后转接；

(5)生根培养：复壮培养后，丛生芽恢复健壮，个体长大，将高度达到2.5厘米的苗转接到生根培养基促使发根，高度不够的弱小芽体重复复壮一次后再生根培养，生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间，培养25天可见发根后即可开始自然驯化；

(6)自然驯化：生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发，瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化，驯化期间温度15-28℃，光照3000-5000lx，驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽；

(7)组培苗移栽：将驯化好的生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟后取出，用72穴筛盘、基质泥炭土种植，种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温；

所述诱导培养基成分中含有DCR基本培养基大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2-3mg/L+NAA(萘乙酸)0.10mg/L+；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.5-5.8；

所述增殖培养基成分中含有1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3-5mg/L+NAA(萘乙酸)0.15-0.2mg/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)0.5-1mg/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％；

复壮培养基成分中含有1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.6mg/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％；

生根培养基成分中含有1/5MS+NAA(萘乙酸)0.5～1.0mg/L+白砂糖25g/L+3.0～5.0g/L活性炭。

2.如权利要求1所述的粗肋草组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中是用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+3滴/升漂白水溶液的TWEEN-20消毒18-22分钟。

3.如权利要求1所述的粗肋草组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤(7)用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1％的高锰酸钾溶液。