[发明专利]一种确定新发现的蛋白标志物对肝癌的诊治应用并测定其功能

权利要求书

1.一种确定新发现的蛋白标志物对肝癌的诊治应用并测定其功能，其特征在于：由以下步骤组成：

一、验证候选蛋白其基因在肝癌组织的差异表达；

对筛选出的肝癌新蛋白标志物，先用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术验证它们在肝癌组织mRNA水平的表达改变；再用Western blot技术验证它们在肝癌组织蛋白质水平的表达改变，进一步筛选出肝癌显示差异表达者；

二、验证候选蛋白的肿瘤生物学功能；

将在肝癌组织的转录和翻译水平都显示差异表达的候选分子作为靶标，通过基因敲入或敲出体内外实验，观察和验证当它们的表达被阻断或上调后对肿瘤生物学行为的影响和在细胞信号调控和作用网络等方面的变化

三、肝癌关键蛋白与临床关系研究；

通过生物信息学分析，解析最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的功能；通过大样本MRM绝对定量验证，计算肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移、疗效等相关分析，提出它们在肝癌的预防、早期诊断、病程预测和预后判断等临床应用方面的可行性。

2.根据权利要求1所述的一种确定新发现的蛋白标志物对肝癌的诊治应用并测定其功能，其特征在于：所述的验证候选蛋白其基因在肝癌组织的差异表达具体是这样实现的：

①RT-PCR验证：用实时荧光定量RT-PCR技术检测候选其调控表达基因在肝癌组织（各10～15例）以及相应的正常对照肝组织（或癌旁组织）的mRNA表达水平，从中筛选出肝癌组织显示差异表达的基因进入下一步筛选；

②Western blot验证：用Western blot技术检测候选蛋白在肝癌组织（各10～15例）以及相应的正常对照肝组织（或癌旁组织）的蛋白质表达水平，从中进一步筛选出在肝癌组织显示差异表达的基因进入下一步功能实验。

3.根据权利要求1所述的一种确定新发现的蛋白标志物对肝癌的诊治应用并测定其功能，其特征在于：所述的肝癌关键蛋白与临床关系研究具体是这样实现的：

①通过IntACT、Reactome、 ConsensusPathDB、LOMA、The Human Protein Reference Database、human protein-protein interaction prediction database等数据库对关键蛋白相互作用进行检索，利用Pajek、cytoscape等软件构建肝癌血清关键蛋白多肽调控网络，解析最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的功能；

②将原发性肝癌和对照样本例数扩大到1000例，以第一部分相对定量结果作为参考，确定最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽的检测范围；体外合成最终所筛选出的肝癌关键蛋白多肽作为标准品，梯度稀释加入血清做标准曲线；MIDAS实验定量分析1000例原发性肝癌和对照样本中肝癌关键蛋白多肽含量；

③计算肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，评价其作为诊断指标的价值；

④分析1000例原发性肝癌样本中肝癌关键蛋白多肽含量与肝癌临床不同病理类型、不同病程、原发与转移、疗效等相关关系，提出它们在肝癌的预防、早期诊断和预后判断等临床应用方面的可行性。

4.根据权利要求1所述的一种确定新发现的蛋白标志物对肝癌的诊治应用并测定其功能，其特征在于：所述的验证候选蛋白的肿瘤生物学功能具体是这样实现的：

①基因敲入：构建单个或多个基因的表达载体；

②基因敲出：构建RNAi 表达载体；

③细胞培养和基因转染；

④肿瘤相关生物学行为的体外实验：MTT 实验，细胞克隆形成实验，细胞生长周期和凋亡实验等；

⑤肿瘤相关生物学行为的体内实验：裸鼠移植瘤实验等。