[发明专利]一种水稻水孔蛋白基因OsPIP2;7植物表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水稻基因工程检测的技术领域，涉及一种水稻水孔蛋白基因OsPIP2;7植物表达载体及其应用。

背景技术

水是植物生长发育所必需的物质，水孔蛋白（Aquaporins，AQPs）是一类可以通透水分和其它中性小分子的膜内在蛋白，在调节生物体内水分平衡过程中发挥着重要的作用。根据蛋白质同源性比较，在大多数植物物种中，水孔蛋白被分成四类，分别是质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）、液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）、NOD26类似内在蛋白（NOD26-like intrinsic protein，NIP）和小分子量碱性内在蛋白SIP（small and basic intrinsic protein，SIP）。

在植物中，首个被发现的水孔蛋白是液泡膜水孔蛋白γ-TIP，并通过爪蟾卵母细胞体系证明它是一个水通道蛋白(Maurel et al., 1993)。水稻中共有4类水孔蛋白，其中PIP有11个，TIP有10个，NIP和SIP分别有10个和2个(Sakurai et al., 2005)。PIP是很重要的一类水孔蛋白，根据N-末端和C-末端的长度及活性不同，PIP又可以分为PIP1和PIP2两个亚类，其中PIP1有3个，PIP2有8个。相比PIP1，PIP2有较长的C末端与较短的N末端。PIP两个亚类通透水分和小分子的功能也有所差异，PIP1家族通透水分的能力较低，但PIP2家族有较强的水分运输效率。

有研究证明，OsPIP2;7在水分快速转运，体内水分平衡，硼离子毒害的耐受性以及冷害耐受性有重要作用（Li et al., 2005, Kumar et al., 2014, Yu et al., 2006）。为了探索OsPIP2;7的更多生物学功能，需要利用OsPIP2;7的转基因水稻进行功能研究。在应用western-blot实验检测OsPIP2;7在转基因水稻中的蛋白质表达量时，由于水孔蛋白属于膜蛋白，抗体获得难度大，商业化的水孔蛋白抗体价格昂贵，并且水稻中的水孔蛋白家族成员多，与OsPIP2;7同源性较高的蛋白有很多个，使用OsPIP2;7抗体时，难以确定western-blot实验中检测的蛋白量是否为OsPIP2;7在水稻中的实际表达量，因此很有必要使用标签蛋白系统。目前市场上应用较广的标签系统包括myc、HA、Flag、His、GST等，其中HA标签系统利用一个HA（流感病毒血凝素，influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA）短肽融合到目标蛋白。HA标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签（HA-tagged）的融合蛋白，也可以用于检测与HA标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测HA tag融合表达蛋白等。

发明内容

本发明将3× HA标签连接在去除终止子的OsPIP2;7蛋白质的C端，得到带有3× HA标签的pHB-OsPIP2;7-3× HA植物表达载体，并对其进行了鉴定。该载体的构建解决了使用水孔蛋白抗体检测OsPIP2;7的蛋白质表达量实验中，可以检测到大量同源蛋白，致使检测到的表达量不准确的问题，为探索OsPIP2;7的新功能提供实验基础。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种含目的基因OsPIP2;7的植物表达载体，其特征在于所述的植物的表达载体为pHB-OsPIP2;7-3× HA；所述的植物为水稻。其水稻质膜水孔蛋白OsPIP2;7-3× HA的核苷酸序列为SEQ ID No.1；OsPIP2;7-3× HA所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

本发明进一步公开了植物表达载体pHB-OsPIP2;7-3× HA在用于准确检测植株体内OsPIP2;7的蛋白质表达量方面的应用。实验结果显示，使用HA抗体可以准确检测转入pHB-OsPIP2;7-3× HA载体的水稻转基因阳性植株体内OsPIP2;7的蛋白质表达量。

本发明主要考察了加入HA标签的植物表达载体pHB-OsPIP2;7-3× HA在植物体内检测OsPIP2;7蛋白质表达量的应用。

本发明重点是解决了植物水孔蛋白的同源蛋白多，检测植物体内的OsPIP2;7蛋白质表达量不准确的问题，使用HA抗体检测结果的条带单一，表达量测定结果准确，并且HA抗体商业化程度高，价格低廉，大幅降低实验成本。

本发明公开的水稻质膜水孔蛋白OsPIP2;7-3× HA的基因序列如下：