[发明专利]一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记开发及应用

说明书

本发明涉及一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记开发方法及应用，属于生物技术领域，该方法包括以下几个步骤：a、通过GWAS方法挖掘与菊花耐涝性显著关联的SNP位点；b、SNP突变位点特异性酶切位点分析及dCAPS引物设计；c、结合基因型与表型数据预期酶切扩增多态性；d、dCAPS标记在自然耐涝极端群体的验证；e、在F₁后代耐涝极端群体中对WT‑dCAPS1标记进行进一步验证。本发明开发了一个与菊花耐涝性状共分离的dCAPS共显性标记，命名为WT‑dCAPS1，在两个群体的平均鉴定准确率为78.9％，初步认为可以应用于菊花耐涝性分子标记辅助育种，大大缩短育种周期，对于培育耐涝性菊花新品种具有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记开发方法及应用，可用于菊花耐涝性分子标记辅助育种。

背景技术

涝渍是危害世界菊花生产的严重自然灾害，培育耐涝性菊花新品种是解决这一问题的直接有效方法。因此，开发与菊花耐涝性相关的特异分子标记具有重要意义。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR等传统的分子标记已经成功应用在菊花种质资源鉴定、遗传多样性分析、连锁图谱构建和关联分析中^[1-5]。随着现代分子生物学的发展及基因组测序计划的进行，SNP标记应运而生。SNP(Singie Nucieotide Poiymorphism)，即单核苷酸多态性，是指基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的插入、缺失、转换和颠倒等。SNP在基因组中分布广泛、数量多，遗传稳定性高、遗传分析重现性好且准确性高，易于快速且高通量地进行基因型分型^[6]。基于以上优点，SNP已经被广泛地应用于多个物种上的全基因组关联分析(genome wide association study，GWAS)中^[7-9]。在菊花上，Chong等人^[10]对199份菊花资源利用简化基因组测序SLAF(specific-locusamplified fragment sequencing)技术，检测到＞46万个SNP，并据此分析了菊花的进化关系。

酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)标记是利用特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种检测SNP位点的DNA标记^[11]。其原理是SNP突变位点位于某种内切酶的识别序列上，经过特异引物PCR扩增后，用相应内切酶对PCR产物进行酶切，从而产生酶切片段的多态性，这样通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色即可显示。但是SNP恰好位于某种限制性酶切位点的这种情况还比较少，于是Michaels和Amasino^[12]及Neff^[13]在CAPS标记基础上，开发了人工引入错配碱基的衍生酶切扩增多态性标记(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)，从而几乎能够将所有SNP位点转换成可以电泳检测的标记。无论是CAPS还是dCAPS，均具有共显性、位点特异性、操作简单、检测快速、成本低廉且不依赖于精密仪器设备等特点，可用于用于植物基因分型、定位、遗传多样性分析、品种鉴定等方面。

菊花属于高度杂合的异源多倍体，复杂的遗传背景限制了其基因组研究的发展。目前应用在菊花上的分子标记大多为显性标记，且较难直接应用在菊花育种工作中。此前，本发明人已经公开了一种采用盆栽模拟淹水法模拟菊花涝害处理以及利用隶属函数法评价菊花耐涝性的专利(106446596A)^[14]；此外本发明人在2016年公开了199份菊花资源的SNP标记^[11]，本专利在以上基础上，首先利用GWAS检测到与菊花耐涝性显著关联的SNP，据此成功开发了一个共显性dCAPS标记，并在具有极端耐涝性差异的两个群体进行验证，结果表明该标记可以用于指导菊花耐涝性分子标记辅助育种。