[发明专利]琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种制备分子式如结构式I所示的琥珀酸酐类化合物的方法，所述方法包括发酵含有编码I型PKS/NRPS酶的基因，以及含有编码ER酶的基因的异源生物，得到发酵液；通过在异源生物中表达I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成所述的琥珀酸酐类化合物；其中，

所述I型PKS/NRPS酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述ER酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第一表达载体上；编码所述ER酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第二表达载体上；所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述第一表达载体在连接上所述I型PKS/NRPS酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述第二表达载体在连接上所述ER酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因具有如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；和/或编码所述ER酶的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异源生物为酵母菌(Saccharomyces)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异源生物为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)将所述I型PKS/NRPS酶的基因连接到pGADT7载体上，得到第一表达载体；

2)将所述ER酶的基因连接到pGBKT7上，得到第二表达载：

3)将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化至酿酒酵母中，获得工程菌株；

4)将所述工程菌株接种至酿酒酵母的液体培养基，在30±2℃ 200±50rpm培养10-14小时；按照2％-10％的接种率扩大培养，在30±2℃ 200±50rpm的条件下发酵4-6天，得到发酵液。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从发酵液中分离提纯得到所述的琥珀酸酐类化合物的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与丙酮水溶液混合并进行超声处理，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮混合并进行超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏用凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到凝胶柱色谱分离液；然后对所述凝胶柱色谱分离液进行柱层析，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到柱层析分离液；然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为所述的琥珀酸酐类化合物。