[发明专利]一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基。

背景技术

2006年日本京都大学Yamanaka利用病毒载体将四个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转入小鼠胚胎成纤维细胞和尾部皮肤成纤维细胞中，获得形态和生长特性类似ES细胞的克隆，命名为诱导多功能干细胞，也因此获得了2012年诺贝尔生理或医学奖。此后，不同国家的科学家运用相似的方法，运用逆转录病毒作为载体，将四个转录因子导入不同种属的不同细胞，均获得了诱导多功能干细胞。并在之后的研究中通过囊胚注射iPS细胞得到了具有繁殖能力的小鼠，进一步证明了iPS细胞的多能性。在2007年底有科学家用诱导多功能干细胞技术制备了动物疾病模型，随后，对诱导多功能干细胞疾病模型的致病机理和药物筛选的研究迅速发展，诱导多功能干细胞由于其来源广泛、无伦理约束、无免疫排斥反应等优点逐渐成为全球干细胞的研究热点。

目前培养诱导多功能干细胞的常规诱导培养基主要包括：DMEM基础培养基、FBS、非必须氨基酸、白血病抑制因子等，而且需要在饲养层上才能成功诱导出多功能干细胞。其中白血病抑制因子的主要作用为防止多功能细胞分化，在双倍量的基础上达到诱导的作用。整个实验体系中有多种动物外源成分污染，即使成功诱导得到多功能干细胞，在实验过程中也不能对其细胞表型的形态变化进行精确分析，对诱导多功能干细胞的进一步研究造成影响。

在我国，越来越多的基础实验室开始研究诱导多功能干细胞，而小鼠诱导多功能干细胞的成功制备是各个期望开展诱导多功能干细胞项目的实验室的首要目标。而iPS的研究仍面临两大问题，即得到的iPS纯度以及诱导效率问题。常规的iPS诱导在饲养层上进行，并且诱导培养基中会添加胎牛血清等动物外源性成分，体细胞重编程的效率一般都低于1％，这些问题严重阻碍了对iPS细胞的进一步研究及移植等方面的应用。本发明旨在提供一种无动物血清的小鼠多功能干细胞诱导培养基，并在无饲养层体系对小鼠体细胞进行重编程，既能提高诱导效率，缩短诱导时间，又无动物外源成分的污染，在获得大量小鼠iPS细胞的同时节约了时间和人力成本。

发明内容

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非另外说明，本文中的iPSCs为诱导多功能干细胞的英文简称，KSR为血清替代品的英文简称，NEAA为非必需氨基酸的英文简称，LIF为白血病抑制因子的英文简称，VPA为丙戊酸钠的英文简称，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子的英文简称DMEM为基础培养基的英文简称，MEF细胞为小鼠胚胎成纤维细胞的英文简称。

除非另外说明，本文中的多功能干细胞和细胞均指诱导多功能干细胞。

本发明的目的是提供一种无动物外源性成分的小鼠iPSCs诱导培养基。

本发明的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：

优选地，本发明的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：

更优选地，本发明的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：

本发明的小鼠iPSCs诱导培养基中不含有动物血清，且在无饲养层体系上进行诱导，故无动物外源性成分污染。培养基中添加了非必需氨基酸、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子等成分，在诱导过程中既能诱导体细胞进行重编程，提供所需的营养物质，又能抑制重编程完全的iPSCs细胞进行分化，从而达到高效诱导小鼠体细胞重编程为iPSCs的目的。

附图说明

图1显示MEF细胞的状态

图2显示诱导过程中细胞的形态变化

图3显示诱导过程中克隆出现的天数及克隆数

图4显示诱导的克隆碱性磷酸酶染色结果

图5显示诱导的iPSCs核型鉴定的结果

图6显示诱导的iPSCs转录因子和特异性蛋白的表达结果

图7显示诱导的克隆多能性基因表面标记免疫荧光染色结果

图8显示裸鼠皮下形成的畸胎瘤

图9显示畸胎瘤石蜡切片HE染色结果

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。