[发明专利]一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法。用传代培养、冻存复苏后培养的第三至第十二代的人尿液细胞作为滋养层细胞培养由成年男性包皮成纤维细胞重编的人多能干细胞(hiPS)。本发明使用的人尿液细胞代替传统方法中用的小鼠胚胎成纤维细胞或鼠胚成纤维细胞系，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，且比间充质干细胞更易获得。并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了hiPS细胞的生物学特性和多能干性，为hiPS进入临床应用提供了可能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法。

背景技术

诱导多能干细胞技术被认为是21世纪以来最令人瞩目的干细胞技术。2006年8月，日本京都大学的Takahashi等^[1]在《Cell》上宣称，他们从与胚胎干细胞多潜能性相关的24个基因中，筛选出四个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，将筛选出的四个基因导入小鼠的皮肤成纤维细胞后，将小鼠皮肤成纤维细胞重新编程为具有类似胚胎干细胞特性的一种新型细胞，该细胞能表达胚胎干细胞特异性的表面标记物，并且具备向三胚层各类型细胞分化的潜能，被称为诱导多能该细胞。人类诱导多能干细胞的获得，揭开了利用干细胞进行自体化医疗的新篇章，也使得诱导多能干细胞技术在再生医学、组织工程、疾病想成机制研究、药物研发与个性化治疗等领域拥有了巨大的应用潜力。

在饲养层上培养人诱导多能干细胞能够很好的抑制多能干细胞分化，因为饲养层细胞能够通过细胞与细胞之间的相互作用或通过分泌各种细胞生长因子、基质等来维持诱导多能干细胞的自我更新和分化潜能。但是传统方法中所用的小鼠胚胎成纤维细胞(MouseEmbryonic Fibroblasts,MEF)会给所培养的人诱导多能干细胞带来异源污染，而《一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法》(CN 102161980A)中所提到的以骨髓间充质干细胞作为饲养层，存在着细胞难以获得的限制。尿液细胞属于人体代谢废物时夹带出的肾上皮细胞等上皮样细胞，易获得，且在体外可以扩增至二十代以上，以上特点使尿液细胞在作为饲养层方面具有一定的优越性。

发明内容

本发明的目的是提供一种人尿液细胞(Urine Cells,UC)作为饲养层培养培养人诱导多能干细胞(hiPS)的方法，该方法是通过以下技术方案实现：

1)饲养层的细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的第3至第12代人尿液细胞作为饲养层细胞。制作饲养层时，细胞接种到Matrigel处理过的六孔板，待融合度达到80-90％(约3×10⁴/cm²)，并用10μg/mL的丝裂霉素C处理1小时30分钟，灭活后24小时内使用；

2)人诱导多能干细胞的获得：取成人23-26岁的包皮成纤维细胞，用携带有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子的逆转录病毒感染两次，恢复培养期加入丁酸钠(NaBT)，感染6天时将细胞重新计数铺到用Matrigel处理过的培养板或培养皿上，更换为mTeSR培养基，每2天换液，直到出现胚胎干细胞状的克隆，挑选、扩增培养；

3)人诱导性多能干细胞的扩增培养：显微镜下机械法(玻璃拉针)挑选类似胚胎干细胞的克隆，用Ⅳ型胶原酶消化8分钟，移液器吸头划成小块传到准备好的饲养层细胞上，每天换液，每4-5天传代一次。

4)人诱导多能干细胞的生物学特性和多能性的维持：在以尿液细胞为饲养层上扩增培养15代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人诱导多能干细胞的多能标志表达情况，同时用拟胚体形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否具有向三胚层分化的潜能。