[发明专利]一种OA标志物的建立

权利要求书

1.一种OA标志物的建立，其特征在于：由以下步骤组成：

一、iTRAQ标记结合MALDI－TOF MS/MS技术在骨关节炎STR/ort模型中的应用

①样品准备：STR/ort模型小鼠和对照小鼠各10只，按清洁级动物的饲养要求饲养在半屏障系统中；养至20周龄（成年），每只鼠经眼球取血0.9-1.5 mL； 血样4℃静置1 h 后，5000 r/min离心5 min，取上清液,按50 μL/管装入0.2 mL EP管，做好标注，-80℃保存备用；

②提取STR/ort模型组和对照组血清，将两组分别等体积混合，采用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀后定量，使每组约含100ug总蛋白，依次进行进行胰酶酶解、还原烷基化、iTRAQ 标记等，过程严格遵照iTRAQ试剂盒说明书进行；将iTRAQ标记后的STR/ort模型组和对照组血清酶解产物等量混合，进行一维SCX和二维nano-LC色谱分离后，进入质谱仪分析；

③STR/ort模型组和对照组血清差异蛋白按差异比例>1.2或<0.8，鉴定到的肽段数至少 >2入选，利用Gene Ontology Consortium、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes、protein-protein interaction prediction database等数据库对入选蛋白进行分析，预测它们在OA的系统网络中发挥的功能及可能的相互作用，筛选候选OA标志物；

二、OA标志物验证

①患者样本采集：在知情同意的前提下，采集OA患者血清、关节滑液各20例；填写样本登记单，记录样本名称、编号、取样日期、病历资料等；所有操作尽量在冰上进行；血清或关节滑液样本按50ul/管分装入1.5 mL EP管，-80℃保存备用；

②采用Western blot在10例STR/ort模型小鼠的血清中一一验证候选OA标志物的表达差异，将表达趋势与iTRAQ实验结果一致的标志物纳入下一步实验；

③采用Western blot逐一检测OA候选标志物在OA患者血清、关节滑液各20例中的表达，筛选具有特异性的人OA标志物；

三、OA标志物确认

①患者样本采集：在知情同意的前提下，采集OA患者血清200例；填写样本登记单，记录样本名称、编号、取样日期、病历资料等；所有操作尽量在冰上进行；血清按50ul/管分装入1.5 mL EP管，-80℃保存备用；

②采用ELISA方法检测200例OA患者血清中的候选标志物表达，分析OA标志物与OA病程的关系；

③用OA标志物建立OA疾病诊断模型，盲法筛检200例患者血清，判断OA标志物诊断OA 的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，提出它们在OA的预防、早期诊断、病程预测等临床应用方面的可行性。