[发明专利]一种iTRAQ标记在骨关节炎模型中的使用方法

权利要求书

1.一种iTRAQ标记在骨关节炎模型中的使用方法，其特征在于：由以下步骤组成：

①样本准备：

STR/ort模型小鼠和对照小鼠各10只养至20周龄（成年），每只鼠经眼球取血0.9-1.5 mL； 血样4℃静置1 h 后，5000 r/min离心5 min，取上清液,按50 μL/管装入0.2 mL EP管，做好标注，-80℃保存备用；

②高效液相（LC）去除高丰度蛋白：

样品预处理，STR/ort模型小鼠和对照小鼠各10份血清分别等体积混匀成STR/ort模型组和对照组pool 样，按pool 样:bufferA=1:3比例（即样品25 μL，bufferA75 μL）混合，共100 μL；0.22μm滤膜过滤后，STR/ort模型和对照两组混合血清样本分别用LC分离去除高丰度蛋白；

③调节蛋白样品浓度：

收集LC分离后的非高丰度组分，经超滤管超滤浓缩脱盐，取超滤管内容物测定蛋白含量，调整蛋白浓度至同一水平，并经SDS-PAGE电泳证实后，STR/ort模型和对照组各取100μg 血样进入下一步实验；

④iTRAQ试剂标记：

血样进行酶解、还原烷基化等处理后，分别加入iTRAQ 113、114标记，冻干后，用含0.1% TFA的纯水复溶后进行LC分离；

⑤强阳离子交换柱（SCX）分离：

利用SCX柱在LC上梯度分离样本；柱子：Polysulfoethyl 4.6×100mm column （5μ，200埃）（PolyLC Inc，Maryland，U.S.A）；SCX Buffers：Buffer A(CEX Loading buffer 10mM KH2PO4 , PH3.0 , 25%ACN)；Buffer B(CEX Elution buffer 10Mm KH2PO4, 500mM KCl,25%ACN)；每分钟收集1管；

⑥nano LC点靶分离：

将SCX分离组分收集后冻干，经反相色谱分离并点靶（Tempo LC ）；柱子：MICHROM，CP3/61261/00，0.2×150mm Magic C18AQ 3μ 200埃；靶盘上MALDI-TOF/TOF质谱仪检测；

⑦质谱检测：

质谱采集900-4000 m/z的图谱, 每个靶点累计采集1500 次；高压设置为2 kV，信噪比 S/N设置为 >45, 差异蛋白的分析采用5800 MALDI-TOF/TOF Analyzer 软件。