[发明专利]基于微流控芯片和G-四链体-血红素DNA酶的检测凝血酶用试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.基于微流控芯片和G-四链体-血红素复合物的检测凝血酶用试剂盒，由以下组成：

1)微型小室包被有功能化微球的微流控检测芯片；所述功能化微球为表面通过生物素-亲和素系统修饰有第一凝血酶核酸适配体的微球；所述第一凝血酶核酸适配体具体有如序列表Seq ID No.1所示的核苷酸序列；

2)表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液；所述第二凝血酶核酸适配体具体有如序列表Seq ID No.2所示的核苷酸序列；所述引发探针具体有如序列表Seq ID No.3所示的核苷酸序列；

3)第一发夹探针试剂；所述第一发夹探针具体有如序列表Seq ID No.4所示的核苷酸序列；

4)第二发夹探针试剂；所述第二发夹探针试剂具体有如序列表Seq ID No.5所示的核苷酸序列；

5)发光体系；所述发光体系为氯化血红素、鲁米诺和双氧水的化学发光混合体系。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控检测芯片设置有微型小室，微型小室的数量为2～15个；每个微型小室中包被有功能化微球的数量为10～25个。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述微型小室呈阵列分布；所述微型小室的尺寸为100～150μm宽、100～150μm长、30～50μm深。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，每个功能化微球表面修饰有3×107条第一凝血酶核酸适配体。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每个金纳米颗粒表面修饰有第二凝血酶核酸适配体的数量为20～30条；每个金纳米颗粒表面修饰有引发探针的数量为200～300条。

6.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述第二凝血酶核酸适配体与引发探针的摩尔比为1:8～12；所述金纳米颗粒液的浓度为23～24nmol/L。

7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法和表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒的制备方法；

所述包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)将亲和洗涤后的质量浓度为1％～3％的亲和素修饰微球液和0.3μmol/L生物素标记的第一凝血酶核酸适配体溶液混合孵育，洗涤，得到功能化微球；

2)将所述步骤1)中功能化微球通过微球装载通道进入芯片中的微型小室中，固定，剥离微珠装载片基后，将试剂传送片基和微球固定阵列片基贴合，构建得到包被有功能化微球的微流控检测芯片；

所述表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液的制备方法，包括以下步骤：

A、在巯基修饰的第二凝血酶核酸适配体溶液、巯基修饰的引发探针溶液、二硫苏糖醇溶液和金纳米颗粒混合，在4℃下静置16h；

B、向静置后的混合液逐滴加入缓冲液，混匀静置，25～35℃放置24h后，得到表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述微球为聚苯乙烯；所述微球的粒径为15～25μm。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中亲和素修饰微球液和生物素标记的第一凝血酶核酸适配体溶液的体积比为42～45：2～4。

10.根据权利要求7或9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中亲和素修饰微球中每个微球上修饰的亲和素的个数为0.8～1×107个。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中亲和洗涤用亲和洗脱液包含以下含量组分：20mmol/L的Tris，摩尔浓度为1mol/L的NaCl，摩尔浓度为1mmol/L的EDTA，质量浓度为0.0005％Triton X-100；所述亲和洗脱液的pH值为7.5。