[发明专利]表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55的重组杆状病毒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55的重组杆状病毒及应用。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒为无囊膜，具有双链RNA结构的能够引起草鱼病毒性出血病的病毒。生物信息学数据显示VP55蛋白为基因III型草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白。刺突蛋白在病毒吸附和侵入宿主过程中具有重要的作用，因此，建立能够高效表达可溶性VP55蛋白的表达系统对草鱼呼肠孤病毒科研工作和疫苗等的开发具有现实的意义。然而，VP55蛋白因为其基因结构特征，现有技术构建的原核表达系统表达的VP55蛋白均为不可溶蛋白。应用于分子病毒学的相关研究如不能进行pull down，co-ip等实验操作。

发明内容

本发明公开一种表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55的重组杆状病毒及应用，本发明通过构建pFast-HTA-VP55质粒，利用杆状病毒表达系统，重组表达了带有his标签蛋白的草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55可溶蛋白的杆状病毒，利用此杆状病毒可以感染SF9(昆虫细胞)大量的表达可溶性的VP55蛋白，并应用于分子病毒学的相关操作。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白的重组杆状病毒，所述重组杆状病毒为构建pFast-HTA-VP55重组质粒并转化至Bacmid－X病毒中所产生的。

所述的pFast-HTA-VP55重组质粒的构建方法为以基因III型草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白基因为模板PCR扩增VP55基因片段，将VP55基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点克隆到供体质粒pFastBacTM HT A载体中，获得pFast-HTA-VP55重组质粒。

本发明表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白的重组杆状病毒的应用，所述重组杆状病毒用于感染昆虫细胞从而大量表达可溶性的VP55蛋白。

所述的重组杆状病毒应用于分子病毒学。例如：重组杆状病毒用于感染昆虫细胞从而大量表达可溶性的VP55蛋白，可溶性的VP55蛋白进行pull down，co-ip等实验操作。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过构建pFast-HTA-VP55质粒，利用杆状病毒表达系统，重组表达了带有his标签蛋白的草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55可溶蛋白的杆状病毒。

2、此杆状病毒可以感染SF9(昆虫细胞)大量的表达可溶性的VP55蛋白，并应用于分子病毒学的相关操作。

附图说明

图1：重组杆状病毒感染细胞与普通细胞电镜图。

图2:重组杆状病毒表达的VP56蛋白Westernblot分析图。

图3：SDS-PAGE分析原核表达GST-VP55蛋白的可溶性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

1、PCR扩增：

以本实验室保存的基因III型草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白(VP55)基因为模板扩增VP55基因片段，扩增条件为：

94℃变性1min后进入循环；循环参数为：98℃10sec，55℃15sec，68℃30sec；30个循环后72℃延伸10min。反应结束后用0.6％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2、重组转移质粒pFastBac HT A-VP55的构建

回收PCR阳性产物，通过EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，设计引物，具体如下表1，将扩增到的VP55基因克隆到供体质粒pFastBacTM HT A载体(Invitrogen，美国)中，经酶切和测序鉴定证实构建正确，获得阳性重组质粒pFastBac HTA-VP55。重组质粒pFastBacHTA-VP55经测序验证。重组穿梭质粒rBacmid-VP55的筛选纯化。

表1引物

3、感受态细胞的制备

(1)在含有50μg/mLKan+和10μg/mL Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用DH10Bac菌液划线，37℃培养箱过夜，培养12～20小时。