[发明专利]一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法

权利要求书

1.一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后进行预处理，然后接种到丛生芽诱导培养基上，在培养箱中培养至长出丛生芽；所述的丛生芽诱导培养基包括以下组成：4.43 g/L MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+6.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭；

S2：切取莪术组培苗带芽茎段，在丛生芽诱导培养基上进行15～60天的继代培养；

S3：切取莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3～0.5mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养3～7天后，进行后续装载处理；

S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液LS溶液或60%PVS2溶液在25±2℃条件下处理10～25min；所述LS溶液为含有2 M甘油和0.4 mol/L蔗糖的MS溶液；所述60%PVS2溶液为：含0.15 mol/L蔗糖的MS溶液与100%PVS2按体积比40:60混合；

S5：再将莪术茎尖用100%PVS2溶液作为玻璃化保护液在冰浴条件下处理15～60 min；

S6：将步骤S5处理后的莪术茎尖迅速投入液氮中冷冻16～18h；

所述100%PVS2溶液的组成为：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4 mol/L蔗糖的MS溶液；

莪术茎尖超低温保存后通过以下方法解冻：把莪术茎尖从液氮中取出，用40±2℃水浴解冻1～5min；用US洗涤液在25±2℃环境下浸泡莪术茎尖20～25min；所述US洗涤液为含有1.2 mol/L蔗糖的MS溶液。

2.根据权利要求1所述的莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述嫩芽的长度为3～5mm，步骤S2所述带芽茎段的长度为2～3mm。

3.根据权利要求1所述的莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述预处理的方法为：先用70%乙醇消毒1～3min，无菌水冲洗3～5次，用镊子剥开多余的叶鞘，切掉老化的组织，再用0.13～0.15%升汞消毒12～15min，无菌水冲洗6～8次，用滤纸吸干材料表面水分。

4.根据权利要求1所述的莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述步骤S1在培养箱中培养的条件为：时段1：光照10h，27℃，75%RH；时段2：黑暗14h，25℃，75%RH。