[发明专利]一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法

说明书

本发明涉及一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，具体以根据中国沿海三种常见贻贝紫贻贝、厚壳贻贝和翡翠贻贝的核糖体基因18S rRNA的SNP位点差异，设计一对特异性引物ZHF‑18S‑F/R，可利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术对三种贻贝进行基因分型。本发明摆脱了靠表型进行鉴别的局限性，从分子水平对贻贝品种进行鉴定，具有快速、高效、准确的优点，测序结果显示鉴定成功率为100％。

技术领域

本发明属于贝类鉴定技术领域，尤其涉及一种可用于紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝之间鉴定的方法。

背景技术

贻贝属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，异柱目(Anisomyaria)，贻贝科 (Mytilidae)，广泛分布于温带和亚北极地区的潮间带。我国是贻贝养殖大国，2015年总产量达到84.5万余吨，位居贝类养殖产量的前列，其中主要以养殖和出口紫贻贝(Mytilus edulis)、厚壳贻贝(Mytiloida)和翡翠贻贝(Linnaeus)这三种经济贝类为主。然而光中国沿海就有超过50多种贻贝，贻贝品种间在浮游期、稚贝期外形相似，且自然杂交个体、脱壳贩卖个体、表型受环境塑造后的个体，单凭外形较难区分。开发一套高效实用的贻贝品种鉴定方法，将为贻贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力的依据。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:以待鉴定紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分贝类相近物种，其序列扩增引物为：

ZHF-18S-F:CGTAGTTGGATCTCGGGT

ZHF-18S-R:AAACCGGGAGGTAGGTCAGG。

进一步地，所述的翡翠贻贝的SNP目标扩增片段为 CGTAGTTGGATCTCGGGTCCCAGGCTTGCGGTCCGACGCACGTCGGTTTACTGCTTGT CCTGACCTACCTCCCGGTTT。

进一步地，所述紫贻贝的SNP目标扩增片段为 CGTAGTTGGATCTCGGGTCCAGGCTGGCGGTCCGACGCCTGTCGGTTACTGCCTGCTC CTGACCTACCTCCCGGTTT。

进一步地，所述的厚壳贻贝的SNP目标扩增片段为

CGTAGTTGGATCTCGGGTCCAGGCTTGCGGTCCGACGCCTGTCGGTTACTGCTCGTCCTGACCTACCTCCCGGTTT。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、操作简单灵活：只需要一个加入饱和荧光染料的PCR反应体系和一台常规的实时荧光定量PCR仪器(可加装高分辨率熔解分析模块)，不需要PCR后产物的分离，真正实现了闭管操作，避免了污染的可能性；

2、高通量：能在一台荧光定量PCR仪上在2个小时内实现96甚至384个未知样本的鉴定工作；

3、结果准确直观：不用进行测序和序列比对等步骤，不同物种之间DNA水平的差异以直观的峰图或者溶解曲线形式表现出来，极易区分辨别，鉴定结果与测序结果一致。

附图说明

图1为本发明实施例提供的贝类近缘物种鉴定高分辨率熔解曲线图(其中横坐标为温度℃)，纵坐标为荧光强度的对数值；每条曲线的最高点所对应的横坐标即为该曲线对应的 PCR产物的Tm值)。

具体实施方式

以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。