[发明专利]一种胞内丝氨酸蛋白酶ISPr的编码基因及其重组表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞内丝氨酸蛋白酶ISPr的重组表达及其应用的技术领域。

背景技术

蛋白酶是一种重要的工业酶制剂，其中，碱性蛋白酶约占25%，是一类可在碱性环境下催化蛋白质水解为氨基酸的蛋白酶。碱性蛋白酶广泛应用于加酶洗涤剂工业、食品加工、饲料、制革工业、丝绸脱胶、医药和环保等行业。

我国的碱性蛋白酶研究还存在以下问题：（1）微生物资源开发不足、蛋白酶种类较少；（2）作用范围较窄；（3）酶制剂品种单一、价格昂贵；（4）应用面还不够广等。碱性蛋白酶市场现在仍然是供不应求的状态，当前的研究重点仍然是选育高产碱性蛋白酶菌株，对其进行培养条件优化和相关性质研究，提升我国的碱性蛋白酶品质和产量。

随着人们对蛋白酶的巨大应用潜力认识的不断加深，蛋白酶的研究也开始逐渐转向了在异源宿主中的高效表达，以便更有利于工业的发展。目前已有地衣芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、烟曲霉等来源的蛋白酶基因,分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母中实现了异源表达。虽然大肠杆菌作为一个首选的宿主，成功表达了多种蛋白，但是其作为表达宿主的瓶颈之一，是过量表达蛋白酶时，容易对菌体产生毒性作用并且容易形成包涵体。因此，得到一个能在非低温条件下进行高效表达的蛋白酶工程菌变得至关重要。

发明内容

本发明首先提供了一种编码胞内丝氨酸蛋白酶的基因ISPr，是以从新疆的盐碱地土壤中筛选出的高产蛋白酶菌株LCB10为出发菌株，提取其总基因组DNA，设计引物并结合其全基因组序列分析，通过PCR扩增出ISPr基因片段，该基因全长954bp，编码317aa。

本发明还将获得的基因与载体PET30a连接，构建重组表达载体PET30a-ispr,转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养所得重组大肠杆菌，经过诱导后成功表达该蛋白酶基因。将表达的菌株收集菌体，破碎离心得到上清液，经过阴离子交换层析纯化得到的纯酶制剂具有蛋白酶活性。

本发明所得到的新的丝氨酸蛋白酶其分子量约为35kD,最适温度40^oC，最适pH9.0，该蛋白酶在7%的氯化钠浓度下仍能保持85%以上的蛋白酶活力，这将在皮革工业上和食品工业中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为ISPr基因的的电泳图；M1,质粒marker；1,重组质粒PET30a-ispr；2，PET30a-ispr质粒双酶切；3，基因全长的PCR片段；M2，线性marker。

图2为重组大肠杆菌的蛋白酶表达SDS-PAGE；M，标准蛋白；1，诱导前的菌体；2，诱导后的菌体；3，破菌上清；4，破菌沉淀；5，纯化的蛋白酶。

图3，图4，图5分别为纯化的蛋白酶ISPr的温度，pH、耐盐度等性质。

具体实施方式

实施例一：蛋白酶活性的测定方法

取100µl纯化的蛋白酶加入到200µl 50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，加入100µl的酪蛋白溶液（2%），40^oC水浴锅中反应10min,加入200µl三氯乙酸（6.56%）终止反应，10000rpm离心10min。离心后取上清200µl，加入1ml 碳酸钠（4.24%），200µl福林酚试剂，测定660nm的吸光度。空白以加入TCA后再加等体积的酶液作为空白对照。

实施例二：ISPr基因的获得

提取芽孢杆菌LCB10的基因组DNA,进行全基因组序列测序（由美吉生物完成），结合得到的ORF阅读框，进行相关文献的查阅及数据库的比对，选定了一个新的胞内蛋白酶基因ISPr,与已知的Bacillus subtilis 168来源的ISP-1基因具有82%的氨基酸序列相似性。

实施例三:ISPr基因的表达