[发明专利]猪IFN-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN-γ的方法及其注射液和应用

说明书

本发明公开了一种猪IFN‑γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN‑γ的方法及其注射液和应用，所述猪IFN‑γ的优化基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述制备方法包括：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪IFN‑γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪IFN‑γ。所述注射液包括60μg猪IFN‑γ与70佐剂。使用优化后的基因序列在CHO细胞中制备猪IFN‑γ蛋白时具有产量高、易纯化、成本低、质控容易，且具有良好的活性，可以作为免疫增强剂和治疗药品使用。

技术领域

本发明涉及一种稳定高效分泌表达猪IFN-γ的CHO细胞株及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。干扰素本质是由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为I型和II型IFN；I型IFN主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，II型IFN只有IFN-γ一种。

IFN-γ虽然只有一种基因，但其结构更为复杂，如编码人和鼠IFN-γ的基因长约6Kb，各包含有4个外显子和3个内含子。IFN-γ与I型干扰素(IFN-α与IFN-β)在基因和蛋白质水平上没有明显的相关性(DeGrado,etal,1991)。虽然IFN-γ具有其它干扰素大多数的生物学活性，但在特异性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫调节活性方面要高100-10000倍(Pace,etal,1985)。猪IFN-γ全基因编码166个氨基酸残基，其中包括20aa的信号肽(Dijkmans,etal,1990)，信号肽切除后，产生146个氨基酸的IFN-γ单体，分子量为17.3kD，天然活性状态的IFN-γ是由两个IFN-γ单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白((Boehm,etal,1997)。猪IFN-γ与人、小鼠、猫和犬的IFN-γ分别具有60％,41％,72％和72％的同源性，而与IFN-β及IFN-α家族没有明显的同源性(Farrar andSchreiber,1993)。

目前，对猪IFN-γ的制备主要有大肠杆菌表达、酵母表达、昆虫杆状病毒表达。这些表达方式制备猪IFN-γ都存在了表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难(成本的高低决定了兽用生物制品的产业化)等缺陷。截止目前为止，兽用生物制品中还没有真核细胞表达的重组干扰素的产品，这主要还是因为产量低、成本高导致产业化困难。

另外，在蛋白类药物中，单独直接使用未经修饰的蛋白作为药物，在药代学上来看，药物的半衰期都很短，一般就几个小时。因此，为了延长药物的半衰期和剂量，一般都选择对目的蛋白进行修饰。但是，修饰都会极大的增加成本，不利于药物的推广，特别是在猪用药物中的推广。因此，研发一种可以适当延长半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特别是在该药物的推广使用过程中。

发明内容

本发明要解决的技术问题一是提供一种适合在真核表达细胞中，特别是在CHO细胞中表达重组猪IFN-γ蛋白的猪IFN-γ优化基因序列；二是提供一种成本低、易于推广应用、易于产业化生产的真核细胞制备猪IFN-γ的方法；二是克服现有技术中表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难等缺陷；三是提供了一种可延长半衰期且成本低的注射液及其制备方法。

根据本发明的一个方法，本发明在充分研究CHO细胞蛋白表达时的偏嗜性以及猪IFN-γ原始基因序列(如SEQ ID NO.2所示)的基础上，优化了猪IFN-γ的基因序列，所述优化后的猪IFN-γ的基因序列如SEQ ID NO.1所示。