[发明专利]一种突变型海藻糖合酶的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种突变型海藻糖合酶的制备方法及应用。海藻糖合酶突变体V407M的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；海藻糖合酶突变体K490L的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；海藻糖合酶突变体V407M/K490L的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该突变体制备简单，产量大，纯度高，实现了海藻糖产量的提高，相同条件下，突变体V407M、K490L、V407M/K490L产海藻糖的转化率分别达到了68％、65％、70％，较原始酶的50％均有显著的提高。

技术领域

本发明涉及一种突变型海藻糖合酶的制备方法及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖是自然界中天然存在的一种非还原性二糖，是麦芽糖的同分异构体，由两分子的葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接构成。在细菌、真菌、昆虫和一些无脊椎动物中都发现了海藻糖的存在，其主要功能是作为储能物质和细胞壁的组成成分。随着研究的不断深入，海藻糖在食品、药品、化妆品及农业领域得到了广泛的应用。

随着海藻糖应用不断探索，海藻糖的功能和效果得到认可，这使得海藻糖的市场需求量逐渐增加，目前海藻糖的市场价格仍高于其它双糖，例如蔗糖、麦芽糖，但因为工艺的复杂性，原材料的限制性，以及工业化生产的实用性等方面的因素，海藻糖的产量难以满足市场需求，因此其生产工艺仍然需要不断的创新和提高。随着生物技术的不断发展，海藻糖的获取手段也在不断的改进，主要有微生物提取法，微生物发酵法(包括固定化细胞法和透性化细胞转化法)，双酶法，海藻糖合酶转化法以及工程菌直接转化法。发展至今，海藻糖能够实现工业化生产的方法主要有双酶法和海藻糖合酶法。

海藻糖合酶(trehalose synthase)能够将α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，并且该酶的底物专一性强。目前麦芽糖的制备工艺成熟，制备成本低，且麦芽糖溶液纯度高，因此该转化工艺具有原料优势，便于海藻糖生产的应用。海藻糖合酶转化法通过一步转化，工艺简单，便于调控，因此该方法目前被认为是海藻糖工业化生产的最优方法。

中国专利文献CN104789539A(申请号201510210023.X)公开了一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法与应用，以Thermobifida fusca YX(登录号WP_011291031.1)海藻糖合酶的氨基酸序列为亲本，该突变体在生产海藻糖时的转化率分别达到了69.7％、70.5％、70.3％、69.6％、70.4％、70.9％、72.3％、73.7％，均略高于野生酶的转化率62.2％。中国专利文献CN105524936A(申请号201610073828.9)公开了一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用，以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)海藻糖合酶的氨基酸序列为亲本，该突变体海藻糖转化率由野生型的71.5％提高到74.7％。

发明内容

针对现有海藻糖合酶转化率较低的问题，本发明提供了一种突变型海藻糖合酶的制备方法及应用。该突变的海藻糖合酶转化麦芽糖生成海藻糖的转化率提高。所述突变体包括含有一个或两个相对于Pseudomonas putida P06(登录号AE015451.1)海藻糖合酶活性氨基酸残基的取代。

一种海藻糖合酶突变体V407M，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型海藻糖合酶的基础上，第407位缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)。

上述海藻糖合酶突变体V407M的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有上述海藻糖合酶突变体V407M的表达基因。

根据本发明优选的，所述表达载体为pET-15b质粒载体。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或上述海藻糖合酶突变体V407M的表达基因。