[发明专利]一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株

说明书

本发明公开了一种克唑替尼手性中间体的制备方法及菌株，所述方法以白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以2,6‑二氯‑3‑氟苯乙酮为底物，以甘油为辅助底物，以pH 6～9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～50℃、150～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)‑1‑(2,6‑二氯‑3‑氟苯基)乙醇；本发明利用白地霉ZJPH1704，制备所得产物的光学纯度高，可使反应产率提高至93％，e.e.值99.9％。

(一)技术领域

本发明涉及一种克唑替尼手性中间体的制备，特别涉及一种利用新菌株--白地霉ZJPH1704生物催化不对称合成克唑替尼手性中间体的方法。

(二)背景技术

2,6-二氯-3-氟苯乙醇(其分子量：209.04，CAS号：877397-65-4)是制备克唑替尼(Crizotinib，英文商品名：)的关键中间体。其中S构型化合物(Ⅰ)，即式(Ⅰ-a)为本发明述及的制备克唑替尼关键手性中间体。式(Ⅲ)的化学名称为3-[(R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺。

式(Ⅰ)为2,6-二氯-3-氟苯乙醇，式(Ⅱ)为底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮，式(Ⅲ)为克唑替尼。

式(Ⅰ-a)为式(Ⅰ)的(S)-异构体，式(Ⅰ-b)为式(Ⅰ)的(R)-异构体。

克唑替尼于2011年8月26日获得美国FDA批准使用，是FDA首个批准进入Ⅲ期临床实验的ALK酪氨酸激酶受体抑制剂，可用于治疗非小细胞肺癌。式(Ⅲ)是在专利US7230098中公开的其具体药物结构式。

克唑替尼合成的难点是制备得到其关键手性中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇即式(Ⅰ-a)，根据该手性中间体的合成方法不同，可分为化学合成法和生物合成法两类。

采用化学法制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，需要使用价格昂贵的铱作为催化剂，并且会对环境造成污染。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。

目前，文献报道的生物催化合成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇主要涉及以下几种微生物类型：

Cui J.Jean(Journal of medicinal chemistry，2011,54(18)：6342-6363)等以2,6-二氯-3-氟苯乙酮为起始原料，利用猪肝酯酶催化得到S型手性中间体式(Ⅰ-a)，再在偶氮二甲酸二异丙酯和三苯基膦条件下与3-羟基-2-硝基吡啶反应得到R型手性中间体式(Ⅰ-b)，之后再经还原、溴代、取代、Suzuki偶联等反应制备得到克唑替尼，此路线的收率较低。

刘丽勤等(工业微生物，2016,46,8-42)构建重组大肠杆菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH，实现葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的共表达，并进行偶联转化。当反应温度为30℃，pH 7的条件下，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇产量最高。当投料量为6％时，转化率达93.75％。该方法中使用的纯酶不易保存，且易失活，因此限制了其应用。

梁蕊等(河南师范大学硕士学位论文，2015)构建了乙醇脱氢酶(ADH)表达质粒pADH-pET21a，与pFDH-pET28a共同转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coli BL21-FDH/ADH。利用乙醇脱氢酶(ADH)和甲酸脱氢酶(FDH)双酶偶联制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。