[发明专利]将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用。

背景技术

据IDF统计，2015年全球糖尿病的患病率达到4.15亿人，每11个人中就有1人患糖尿病，其中90％以上的糖尿病患者为2型糖尿病。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide，GLP-1)及其类似物是近年来治疗2型糖尿病的一类新型药物，能够促进葡萄糖浓度依赖性的胰岛素分泌，实现胰岛β细胞的保护和α细胞的调节作用，从而达到稳定的降糖效果，不易诱发低血糖。

由于GLP-1及其类似物在治疗2型糖尿病的优良效果，使其近年来在糖尿病治疗药物市场中逐渐占据重要地位。人体内具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)，天然的GLP-1容易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)迅速水解失活，不具有临床使用价值。因此对GLP-1结构修饰，形成具有同样药理活性的GLP-1类似物，并掩盖DPP-Ⅳ的结合位点，延长半衰期是该类药物研发的主要课题。如今已有多个GLP-1类似物上市，如：利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽等，该类药物在未来10年里将会是抗糖尿病药物的重要增长点。

利拉鲁肽属于长效GLP-1类似物，是一类具有显著降低血糖水平及修复胰岛细胞功能的肠促降糖激素，能模仿人GLP-1葡萄糖浓度依赖性的降糖活性，抑制患者胃肠运动和排空，避免口服类降糖药和胰岛素类降糖药的不足，如体重增加、长期血糖浓度及HbA1c水平控制不佳、严重低血糖等不良反应，显著提高患者的生活质量，是治疗2型糖尿病的理想药物。

利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，其序列为：

H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

由上述利拉鲁肽结构可以看出，利拉鲁肽分子是在Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段的基础上，在Lys²⁶侧链上连接一个十六碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))而得。目前对于利拉鲁肽的生产制备工艺上，可以分为化学与生物两大途径。

化学方面，主要是采用化学合成多肽的方法。中国专利CN102875665、CN103275208、CN103304660等公开了利拉鲁肽的化学制备方法，但这些化学合成方法需要用到大量的有机溶剂，对环境造成严重污染，并且化学合成副反应较多，产率低，所使用的氨基酸原料成本高，整体生产成本较高。

与化学合成法相比，生物法在环境友好性、工艺简单以及成本低廉等方面的优势而受到人们的重视。目前主要是采用基因重组工程菌发酵得到含Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白片段之后，再对其进行酰化修饰，即在Lys²⁶侧链上连接上十六碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))。这种制备思路的难点在于Arg³⁴-GLP-1(7-37)蛋白的制备及修饰。

目前来说，大肠杆菌比较多地被用于GLP-1衍生物的发酵生产。这是因为利用大肠杆菌作为宿主表达Arg³⁴-GLP-1片段，相较酵母具有更容易融合表达，产量高，无糖基化及酶干扰的优势。因而，大肠杆菌也逐渐成为GLP-1衍生物的主要生物生产途径。目前在大肠杆菌生产利拉鲁肽方面，普遍是将Arg³⁴-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽进行表达，然后将分子伴侣及连接肽用特异性工具酶切除，得到Arg³⁴-GLP-1(7-37)后再对其进行修饰得到利拉鲁肽。例如中国专利CN104745597A公开了一种高效表达重组利拉鲁肽蛋白的方法，该方法是将Arg³⁴-GLP-1(7-37)通过肠激酶酶切位点连接HIS标签形成基因片段HIS-EK-(Arg³⁴-GLP-1(7-37))，然后将基因片段载入大肠杆菌中进行该融合蛋白的表达。利用HIS标签亲和吸附得到融合蛋白后，再利用肠激酶特异性酶切肠激酶位点得到Arg³⁴-GLP-1