[发明专利]CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法

说明书

本发明是根据小鼠FGF5基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的sgRNA表达载体，将sgRNA和Cas9 质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因突变鼠，并pcr测序，确认最终得到遗传性小鼠突变模型。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为小鼠FGF5基因的敲除提供了一种简便快速安全的途径，该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系，大大提高了转基因动物的安全性，对小鼠的遗传育种具有重要价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是细菌、古细菌通过长期的进化，自我产生的一种有效抵御外源DNA入侵的适应性免疫。而人类对Ⅱ型CRISPR/Cas 系统的改造使其成为继锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)和TALEN核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术，该系统中成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）转录出的mRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas proteins）人为改造成sgRNA（small guide RNA）及Cas9蛋白。CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别靶序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂(DNA double-strand break，DSB)，断裂的DNA为防止被降解会自动启动内源性修复机制，其中同源重组（Homologous recombination，HR）修复机制以及修复模板存在的条件下，可以实现定点单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变，从而完成基因的敲入与敲除。

20世纪30年代，科学家发现大脑和垂体的组织提取物中存在一种能促进成纤维细胞生长的活性物质，该物质直到到70年代才被分离提纯，根据其生物学功能，这种物质被命名为成纤维细胞生长因子。到目前为止已经鉴定出23种人或鼠的FGFs，其中18个哺乳动物FGFs按照其序列的同源进化关系分成6个亚家族：FGF1和FGF2；FGF3，FGF7，FGF10；FGF22；FGF4，FGF5，FGF6；FGF8，FGF17，FGF18；FGF9，FGF16，FGF20；FGF19，FGF21，FGF23。FGF11~FGF14也与其它的FGFs序列具有髙度的同源性，但是目前还没有找到该因子相应的受体，故没有对其进行分类。FGF15是人类FGF19同源的鼠源因子。FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。

生长因子5（Fibroblast growth factor 5，FGF5）是FGF基因家族中的一个成员，具有与其他成员类似的基因结构，包括三个外显子和两个内含子，翻译后可剪接成两种蛋白产物，FGF5S较短，不包括第二个外显子，FGF5较长，包括三个外显子。

利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠FGF5基因的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法，其是根据小鼠的FGF5基因序列(Gene ID 14176)，构建基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，将sgRNA和Cas9质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因敲除鼠，并PCR测序,确认最终获得FGF5基因敲除小鼠。

本发明中述及的小鼠包括但不限于CD-1品系小鼠。