[发明专利]一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：合成重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的核酸序列；利用所得重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的核酸序列构建载体，转染宿主细胞，筛选高表达的细胞克隆，建立细胞库；利用所得细胞株进行培养，分离纯化，获得重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体。本发明根据中国仓鼠偏爱密码子设计合成重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的轻链、重链，构建真核表达载体，转染宿主细胞CHO‑GS^‑，并采用无血清培养技术培养，分离纯化，获得高纯度的重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体。本发明制备方法操作简单，生产周期短，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Rrthritis，RA)，是以关节滑膜的炎症为主要特征的一种慢性、侵蚀性、对称性、小关节、多关节为主的全身性自身免疫病，严重影响患者的生活质量。

TNF-α是促使滑膜炎症发生的常见细胞因子，在发病机制的网络中居于重要位置。TNF-α是一种多效性前炎症因子，在炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症介质之一：以自分泌和旁分泌方式激活单核巨噬细胞，使其产生大量IL-1、IL-6、IL-8等促炎症因子，引起级联反应，放大信号传导；还可以进一步激发体内细胞间黏附因子(ICAM)的高度表达，导致组织内抗原不能被及时遏制或清除；可联合其他类分湿因子与抗原形成较大的抗原-抗体复合物，并在关节腔内沉积，进一步难以清除。最终造成正常组织损伤，关节肿大，弯曲变形。

阿达木单抗(Adalimumab)，商品名为修美乐(Humira)，是一种抗TNF-α的人源化抗体产品，于2002年被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)，可特异性地与TNF-α结合并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，从而阻断炎症反应的产生，对于慢性炎症疾病具有显著效果。

目前，单克隆抗体以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术为制备手段已是一种常规方法，而治疗性单抗药物也已成为生物技术药物的热点，现行的四代抗体技术-全人源化也日渐成为一种趋势。但面对国外针对阿达木单抗的技术垄断，国内仿制药行业技术手段水平参差不一，造成抗体的表达量、稳定性、效价等结果差异明显，国内抗体药水平始终落后于国外公司，国内患者的生活质量不能得到有效保障。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法。本发明发现，通过对表达载体进行改造和优化，将有可能获得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的高效表达和结构稳定。本发明中采用无血清分批补料式培养方式，防止了交叉污染、病毒污染，保证了产品质量。

本发明提出的一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

a)合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列；重组抗TNF-α全人源单克隆抗体具有轻链和重链，其中轻链的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；重链的可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

b)利用步骤a)所得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列构建载体pHL101-GS/Neo，转染宿主细胞，筛选高表达的细胞克隆，建立细胞库；

c)利用步骤b)所得细胞株进行培养，分离纯化，获得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体。

优选地，步骤a)中，采用中国仓鼠卵巢细胞的偏爱密码子合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列。

优选地，步骤b)中，所述构建载体过程中，包括构建表达重链的载体、构建表达轻链的载体、构建双真核启动子驱动表达重链和轻链的载体。