[发明专利]一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及土壤微生物的科学研究领域，更具体涉及一种研究土壤产甲烷古菌的方法，同时还涉及一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，该装置同样适用于同位素标记和示踪植物有机碳在土壤中的分解与转化。

背景技术

甲烷（CH4）是重要的温室气体之一，其百年尺度增温潜势是二氧化碳的25倍（IPCC,2007）。CH4在大气中的浓度逐年上升，对全球气候和环境产生了极为严重的威胁。而稻田是重要的CH4排放源之一，其每年的CH4排放量占全球人类活动造成的CH4排放总量10%（Nazaries et al., 2013），所以对稻田土壤甲烷排放的研究具有十分重要的意义。稻田甲烷排放是CH4产生过程和CH4消耗过程的净效应（Le Mer and Roger, 2001）。CH4产生过程是产甲烷菌在严格厌氧条件下作用于有机肥料、动植物残体、土壤腐殖质以及水稻根系分泌物等土壤有机质的结果。而13C同位素可以对植物和微生物进行标记和示踪，并进一步结合稳定同位素探针技术等分子生物学手段来研究土壤中的产甲烷古菌。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法，该方法简单易行，对产甲烷菌的标记效果好。通过在标记装置内加入13C-CO2，植物利用13C-CO2进行光合作用，进而合成13C-有机质，部分13C-有机质以根系分泌物的形式分泌到土壤中，产甲烷菌消耗这部分13C-有机质，形成13C-产甲烷菌，通过后续分子生物学手段可将这部分13C-产甲烷菌分离出来，进而了解其群落组成结构。而且本方法能对植物进行单盆同位素标记，减少了不同处理样品间的相互影响。

本发明的另一个目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，该装置可以对土壤微生物进行同位素标记。装置结构简单，使用方便；水封的设计更增加了密封效果，外界气体不易进入标记罩内；装置设有浇水口，即使进行长期标记，也能保证植物的正常生长；而且装置小巧，不占用大量空间，在任何实验室均可方便的操作。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法，包括如下步骤：

1）培养盆装土，加去离子水，保持淹水状态，2－4厘米水层；称取1－2kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为10×16cm（直径×高），土层厚度12－14cm。加去离子水，水稻栽培期间一直保持淹水状态，2－4厘米水层。

2）淹水一周后，在盆养盆内移栽水稻幼苗；选取长势相同的水稻幼苗，苗龄为18－22天，移栽至培养盆中，每个盆中移栽4－6株幼苗。

3）在水稻分蘖盛期时，开始标记13C-CO2气体。13C-CO2是通过13C-碳酸钠溶液（浓度为1M）与硫酸（浓度为2M）反应生成。

4）每天标记时间段为9:00-16:00，每小时标记一次，共标记7天。标记时，用1.5ml注射器吸取1.2ml 13C-碳酸钠溶液（1M），通过罩子顶部的三通阀，注射到装有过量硫酸（2M）的塑料小白盒中，13C-碳酸钠液体立即与硫酸反应，生成大约35ml的13C-CO2，顶部的小风扇可将罩子内气体混匀，以便水稻充分利用13C-CO2进行光合作用。每天从上午9:00到16:00的7个小时内，即光合作用最强的7个小时内，每个小时注射一次，连续标记7天。用同位素质谱仪检测植物，土壤以及气体中13C同位素丰度，来检测该方法的同位素标记效果。

一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，它由PVC管、不锈钢方盘、有机玻璃罩、小白盒（内有硫酸）、硅胶管、标记口、电线、小风扇、采气口、植物、浇水口、培养盆组成，其连接关系是：不锈钢方盘分别与PVC管、有机玻璃罩相连，不锈钢方盘和PVC管相连组成的底座中装有植物，有机玻璃罩顶端与小风扇相连，小白盒与小风扇相连。在有机玻璃罩上开有标记口、采气口、浇水口，第一硅胶管与标记口相连并放置于小白盒内，第二硅胶管与浇水口相连。带插头的电线分别与小风扇和电源相连。