[发明专利]一种血浆DNA边提取边转化的方法及应用

说明书

本发明涉及一种血浆DNA边提取边转化的方法及应用，所述方法包括如下步骤：裂解、转化、分层、结合、漂洗、脱磺基、干燥和洗脱。洗脱后获得的液体即为提取转化后的游离DNA。本发明巧妙地将游离DNA的提取和转化过程合二为一，所述合二为一并不是简单的将提取和转化两个步骤简单叠加，而是采取边提取边转化的方式，即血浆被裂解处理后就开始进行游离DNA的重亚硫酸盐的转化过程，经过分层液处理可以轻易的去处蛋白质，后续纯化的是经转化后的游离DNA(BiscfDNA)，相比于传统的方法先纯化cfDNA，转化后再纯化BiscfDNA的过程，大大节省了时间，降低了成本，也减少了BiscfDNA的损失。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种血浆DNA边提取边转化的方法及应用。

背景技术

虽然检测DNA甲基化的方法有很多种，但是在众多方法中，研究人员首先都会使用到一项技术，那就是DNA的重亚硫酸盐转化。DNA的重亚硫酸盐转化会将DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化了的胞嘧啶则保持不变。因此，通过随后的测序、甲基化特异性PCR或芯片等分析手段来比较处理前和处理后的DNA序列，就能确定DNA待检序列中哪些碱基是甲基化了的。

尽管这种转化在理论上很简单，但是重亚硫酸盐转化真正要做起来却并非那么容易。目前的亚硫酸盐转化基本步骤分为：DNA的分离纯化，氢氧化钠变性、亚硫酸盐变温转化及脱磺酸基和脱盐。重亚硫酸盐转化的条件非常苛刻，比如在反应体系中需要提供高浓度的重亚硫酸盐来完成未甲基化胞嘧啶的转化，而且还需要保证双链DNA分子长时间处于解链状态以便于进行有效的转化。因此，DNA重亚硫酸盐转化的体系通常是一种高盐，高温和低pH值的条件。但是在这种条件下，反应体系中会产生大量的活性氧基团，这种活性氧会使DNA发生片段化并发生降解，因此将导致转化后的PCR及后续分析技术灵敏度降低，同时也会导致DNA的回收率下降，有时甚至达不到50％。

CN 105462960 A公开了一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，该方法不需要对核酸进行前期的氢氧化钠变性处理，在恒温条件下进行转化实验；采用磁珠法进行甲基化核酸转化后的核酸纯化，利用高盐低pH值进行核酸的分离纯化，再通过低盐高pH值进行洗脱，同时只采用一次洗涤步骤，能够得到高转化率、高质量、高纯度的DNA。但其并不能直接对游离的DNA直接进行提取转化。

现有技术中获得BiscfDNA(亚硫酸盐转化过的游离DNA)具有如下缺陷：(1)没有专门针对游离DNA转化并用生物磁珠纯化的技术，因游离DNA的特殊性，长度短(100-300bp)且含量低(1-100ng/ml血浆)，用市场上现有的对基因组DNA长时间高温处理的方法，对游离DNA的讲解很严重，同时用柱纯化法也很难纯化到低量片段化的游离DNA；(2)如果用市场上现有技术获得BiscfDNA，必须先用血浆游离DNA提取技术(磁珠法)获得游离DNA(cfDNA)，然后再用亚硫酸盐转化技术获得BiscfDNA，此过程不但用时长，操作繁琐，还无法做到完全的衔接，并且还必须经历两轮洗涤纯化过程即先纯化cfDNA，转化后再纯化BiscfDNA，这大大增加了游离DNA的损失量，这对于本身含量就低的游离DNA来说无疑是致命的。

因此，有必要开发一种可以将提取过程和转化过程合二为一的方法，寻找一种边提取边转化的方法。

发明内容

针对目前的问题，本发明提供了一种血浆DNA边提取边转化的方法和应用，所述方法将游离DNA的提取过程和转化过程合二为一，在三小时内便能提取出高质量的BiscfDNA，大大节省了时间和材料，减少了BiscfDNA(亚硫酸盐转化过的游离DNA)的损失。

为达此目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种血浆DNA边提取边转化的方法，包括如下步骤：

(1)裂解：向血浆中加入裂解缓冲液和蛋白酶K进行裂解；

(2)转化：向步骤(1)的混合液中加入重亚硫酸盐粉末，进行转化；