[发明专利]一种通路克隆入门载体的构建方法

权利要求书

1.一种通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)引物设计

根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计基因扩增引物ICS1pro-F1和ICS1pro-R1，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计菌落PCR引物ICS1pro-F2和ICS1pro-R2；

(2)ICS1pro片段的扩增与纯化

以CTAB方法提取的日本晴DNA为模板进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；

(3)pCR8片段的获得

采用通路克隆入门载体pCR8-AtS5H作为原始载体，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到pCR8片段；

(4)pCR8-ICS1pro质粒的构建

利用一步SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，采用菌落PCR验证和测序进行鉴定，从而最终得到阳性入门克隆载体pCR8-ICS1pro；

步骤(1)中，所述水稻采用日本晴。

2.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因扩增引物ICS1pro-F1：5’-GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG-3’；

引物ICS1pro-R1：5’-AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG-3’；

菌落PCR引物ICS1pro-F2：5’-TTGGCTTGGGTAGGATTA-3’；

菌落PCR引物ICS1pro-R2：5’ACGAAGGAGCGAAGGTTA-3’。

3.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应体系为(总体积50μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTP 10μL，10mM引物ICS1pro-F11.5μL，10mM引物ICS1pro-R11.5μL，KOD FX 1μL，DNA 1μL，ddH₂O 10μL。

4.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火30s，68℃延伸3min，共30个循环；68℃延伸10min。

5.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述单酶切的反应体系为：10×H Buffer 5μL，EcoR I 2.5μL，pCR8-AtS5H质粒(100ng/μL)20μL，ddH₂O 22.5μL；37℃下酶切3h。

6.如权利要求1所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，利用SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接的反应体系为：10×NEB Buffer 21μL、100×BSA 0.1μL、ICS1pro片段(80ng/μl)3μL、pCR8片段(30ng/μl)4μL、ddH₂O 1.9μL、T4 DNA polymerase 0.2μL。

7.如权利要求1至6任一项所述的通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，所述菌落PCR验证的反应体系包括2×Taq Master Mix 5μL、10mM引物ICS1pro-F2 1μL、10mM引物ICS1pro-R2 1μL和ddH₂O 3μL；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸10min。