[发明专利]一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法

说明书

本发明提供一种双基因敲除载体系统，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6任一项所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。通过上述载体系统可以简单、快速、高效地定点同时敲除CD163基因和CD13基因。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法。

背景技术

猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被称为“蓝耳病”。该病于1987年首次在美国被发现，紧接着于1989年在欧洲爆发，1995年底在中国大陆首次爆发，猪群的感染率高达90％，给养猪业带来了极大的经济损失，已成为世界范围内一种严重危害养猪业的传染病。

PRRSV在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages，PAM)。PRRSV侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素(Heparin Sulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)和CD163(Cluster of Differentiation 163)分子是PAM上存在的能与PRRSV结合的三个重要受体分子。其中，CD163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的Ⅰ型糖基化蛋白，也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kD，固又被称为M130蛋白。CD163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在PRRSV非易感细胞系(BHK-21和PK-15)中转染表达CD163分子可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。CD163蛋白结构域SRCR5是病毒感染细胞所必需的，而氨基端的4个SRCR和胞质尾部是非必需的，其中SRCR5结构域正是由CD163第7外显子所编码。因此，研究CD163基因修饰猪可以为CD163受体是否是PRRSV感染过程中的重要角色提供必要证据。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的高度传染性肠道疾病。任何年龄的猪均可感染，对仔猪影响尤其严重，病死率非常高，特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。

最近的研究表明PEDV主要通过与猪小肠黏膜上皮细胞中的CD13(APN)结合感染仔猪。CD13作为PEDV侵入细胞的必要结合受体意义重大，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的APN基因来阻止PEDV对猪的感染。

因此，建立一种可以快速、准确、有效地同时敲除猪CD163基因和CD13基因的方法，获取敲除猪CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞或猪在研究猪蓝耳病和猪流行腹泻腹泻以及抗病猪育种方面具有重要的意义。