[发明专利]利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，特别涉及一种通过添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，制备绵羊性控冷冻精液的方法，有效提高绵羊性控冷冻精液活力，从而达到提高受胎的目的、制备家畜性控冷冻精液。

背景技术

家畜精子分离-性控技术从2000年产业化以来，目前已经在全世界十余个国家推广应用。目前，牛、猪、鹿等家畜动物性别控制技术都已陆续开发成功，牛的性控冷冻精液也已大规模进行生产并推广应用。而有关绵羊性别控制技术及其应用方面的报道很少，绵羊的性控冷冻精液研究尚处于起步阶段，主要问题集中在精子活力低，直接影响受胎率。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种水溶性高分子化合物，具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能。据Yutaka等人在2000年的研究表明，PVP用于猪精子的稀释液中可延缓精子的运动速度，减小精子的动能损失，从而延长精子的保存时间。由Dozortsev在1995年的研究可知，PVP用在精子稀释液中可以形成保护膜，能减少外界环境对精子造成的损害。为了提高绵羊性控冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升绵羊冷冻精液品质，研究开发了添加PVP的绵羊性控冷冻精液的制备方法。

发明内容

本发明提供了一种利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法，该技术原理是利用具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能，在绵羊精子冷冻的过程中添加PVP，对精子形成保护膜、减缓精子运动，从而提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

1、10％PVP的配置：

称取0.5g的PVP加入5ml的蒸馏水，室温溶解，配置成10％PVP浓储液，4度保存1月；

2、冷冻液Tris-A、Tris-B的配置：

3、精液检查：

①外观评定

1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；

2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；

3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；

②活力检测

取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行分离；

4、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定

①绵羊精液经过步骤3检查完后，取1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；

②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度；

5、添加PVP性控冷冻精液的制备：

①取步骤4测完浓度的绵羊精液染色后上机分离，分离后的精子放入4度室平衡90分钟；

②在冷冻液TrisA、TrisB中添加步骤1配置的10％PVP，使PVP的终浓度为0.5％，添加完PVP后，将TrisA、TrisB各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；

③将步骤①平衡好的精子离心，去掉上清,按照精子终浓度计算所需总体积的一半加入TrisA与1/2Tris A体积的Tris-B，间隔15分钟后,再加入1/2Tris A体积的Tris-B，每次添加后颠倒轻轻摇匀；

④装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存。

本发明的优点和有益效果是：在绵羊精子冷冻的过程中添加PVP，对精子形成保护膜、减缓精子运动，提高了解冻后精子活力和延长了精子存活时间，达到受精受胎的目的。

具体实施方式

实施例：一种利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法，以绵羊性控冷冻精液为例，它包括以下步骤：

1、10％PVP的配置：

称取0.5g的PVP加入5ml的蒸馏水，室温溶解配置成10％PVP，4度保存1月，

2、冷冻液Tris-A、Tris-B的配置：

3、顶体检测液配制

①花生凝集素FITC-PNA染液的配置

将1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10ml PBS缓冲液中，然后分装避光保存在-20℃；

②PBS缓冲液：