[发明专利]快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物及其检测方法和应用

说明书

本发明涉及一种快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物及其检测方法和应用，所述引物的序列为：上游引物N6‑F1：5’‑TATAAACATTCCAAACATGA‑3’，下游引物N6‑R1：5’‑TTCACATAGCGGCTTGGTCA‑3’，利用该引物建立实时荧光定量PCR方法，根据实时荧光定量PCR反应结束后的溶解曲线存在Tm值的差异，直接对不缺失型神经氨酸酶N6基因以及缺失型神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断，本发明鉴定方法简单、方便高效、准确率较高，可应用于对N6基因型进行快速鉴别。

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物及其检测方法和应用。

背景技术

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病，可引起禽类出现大量死亡、产蛋量下降、严重的呼吸道系统综合症或隐性感染等多种病型。

目前禽流感遍布世界各地，给各国养禽业造成巨大的经济损失。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)基因组为单股负链分节段的RNA，其基因组分为8个片段，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。依照流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)结构及特性的不同，可将A型流感病毒分为若干亚型，迄今共发现18种HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)。

H5N6亚型AIV是近年来发现的基因重组型禽流感病毒，有研究表明当前流行的H5N6亚型禽流感病毒的NA基因存在缺失和不缺失两种类型。从NCBI上下载已知的H5N6亚型禽流感病毒的NA基因序列，利用分子生物学软件(MEGA6)进行分析发现，N6基因确实存在缺失和不缺失两种类型。

又有研究表明H5N6病毒在NA茎中11个氨基酸(33个核苷酸)的缺失，可能有助于增强其与人类受体的亲和力和对哺乳动物的致病力，而且这两种类型的N6基因(缺失型和不缺失型)各自分为两个亚分支。目前含有这两种类型NA的H5N6亚型禽流感病毒流行，亟待一种鉴别缺失型N6基因和不缺失型N6基因的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高敏感、高特异性的快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物和应用及其快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物，所述引物的序列如下：

上游引物N6-F1：5’-TATAAACATTCCAAACATGA-3’，

下游引物N6-R1：5’-TTCACATAGCGGCTTGGTCA-3’。

一种快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR检测方法，利用上游引物N6-F1：5’-TATAAACATTCCAAACATGA-3’和下游引物N6-R1：5’-TTCACATAGCGGCTTGGTCA-3’建立实时荧光定量PCR方法；所述引物对不缺失型神经氨酸酶N6基因以及缺失型神经氨酸酶N6基因的扩增需要跨过基因缺失区，造成因核苷酸碱基连续缺失导致GC含量差异，根据实时荧光定量PCR反应结束后的溶解曲线存在Tm值的差异，直接对不缺失型神经氨酸酶N6基因以及缺失型神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断。

所述的快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物的应用，在制备区分神经氨酸酶N6基因型试剂盒上的应用。

所述的快速区分神经氨酸酶N6基因型的实时荧光定量PCR引物的应用，在检测不缺失型神经氨酸酶N6基因病毒以及缺失型神经氨酸酶N6基因病毒感染情况方面的应用。

为了表述方便，本发明所述的不缺失型神经氨酸酶N6基因命名为N6-L，所述缺失型神经氨酸酶N6基因命名为N6-S。