[发明专利]人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的的重组蛋白质类的数量和种类正在不断的增加，并且已经成为医药工业的重要部分。重组药物蛋白的表达系统主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳动物细胞系。E.coli适合表达分子量较小、结构相对简单的蛋白质，酵母表达系统适合表达分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质。结构复杂或糖基化对于蛋白质的活性非常重要，非人源化哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translational modifications，PTMs)，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。而哺乳动物表达系统生产重组蛋白，存在产量低，稳定性差等问题。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达系统是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％的药物蛋白是采用CHO细胞生产的(如抗体)。

但是CHO细胞表达系统也存在目的蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰(A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines:what makes a stable high producer？Biotechnol.Bioeng.2009)。

核基质结合区序列(matrix attachment region，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异(Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells.Nat.Methods.2007；Positional effects of the matrix attachment region on transgene expression in stably transfected CHO cells.Cell Biol.Int.2010)。然而，MAR元件较大，常用的MAR如公开号CN106520832A的发明专利公开了一种双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用，其所述的β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位碱基)、X-29序列(GenBank：EF694970.1，第1～3337位碱基)、β-干扰素MAR序列(GenBank：M83137.1，第1～2201位碱基)、MAR 1-68(GenBank：EF694965.1，第1～3614位碱基)的大小均在2000bp以上，一方面会增加载体构建难度，另外质粒的转染效率会随着载体的大小的增加而降低，从而限制了MAR元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供了人工合成MAR片段。

本发明还提供了上述人工合成MAR片段的应用。

本发明还提供了包含上述人工合成MAR片段的表达载体。

本发明还提供了上述表达载体的应用。

本发明还提供了包含上述表达载体的表达系统。

本发明还提供了上述表达系统的应用。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

人工合成MAR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1(MAR-1)、SEQ ID NO.2(MAR-2)或SEQ ID NO.3(MAR-3)所示。本发明的MAR片段是在分析β-珠蛋白MAR序列、X-29序列、β-干扰素MAR序列、MAR 1-68序列的基础上，根据其共有的序列特征设计合成了一种新型的MAR片段，与天然MAR序列相比，提高CHO细胞转基因表达水平效果更为显著。优选为MAR-1序列，本发明中发现MAR-1、MAR-2、MAR-3同时用于CHO细胞中外源蛋白的表达时，MAR-1的效果最好，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的系统相比，稳定细胞株的细胞池(cell pool)可提高5.04-5.47倍。