[发明专利]一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法。本发明提供了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA。本发明添加了微生物细胞的洗涤和富集步骤，降低了宿主和食物DNA的污染；组合多种微生物细胞裂解破碎的方法，降低宏基因组DNA的物种偏好性；增加纯化的步骤，保证DNA的纯度，可以满足构建第二代高通量测序文库的DNA要求。

技术领域

本发明涉及宏基因组学领域，具体地说是一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，所获得的宏基因组DNA满足构建第二代高通量测序文库的要求。

背景技术

宏基因组是生物环境中全部微生物的遗传物质的总和，即微生物群体的基因组，目前主要指细菌、古细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学以微生物群体基因组为研究对象，研究微生物的遗传物质组成及微生物群落功能。近年来，随着高通量测序技术的发展和测序成本的降低，宏基因组测序技术已经逐渐渗透到诸多领域，人们对微生物菌群获得了全新认识，这些认识是依靠传统微生物培养方法无法获取的。微生物菌群宏基因组学的研究为医疗健康、环境能源和畜牧业等领域提供了重要的研究资源。

人和动物的体表和体内存在数量巨大且种类繁多的微生物，与健康关系密切。目前已知不同部位的微生物数量相差很大，据估算人体皮肤表面的微生物约为10⁷/cm²,唾液约为10⁹/mL，胃和小肠上段(十二指肠和空肠)的微生物约为10³-10⁴/mL,小肠下段(回肠)约为10⁸/mL，大肠(结肠)约为10¹¹/mL。人体大部分的微生物是肠道微生物，甚至约90％的微生物都集中在结肠内。人体肠道排出的每克粪便含有约1千亿个细菌，粪便干重约三分之一为细菌。肠道微生物如今已成为人类和动物健康的研究热点，研究表明，肠道微生物能影响宿主的营养吸收和免疫功能等，与多种疾病密切相关，例如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等。

由于取样和DNA提取的方便性，新鲜的粪便样品是目前肠道微生物宏基因组研究的主要样品。然而排出的粪便样品与体内肠道微生物有差异，尤其与胃和小肠部分(十二指肠、空肠、回肠)的微生物在数量和种类上都存在较大差异，因此，以粪便为对象的肠道微生物宏基因组学研究所能得到的结论具有局限性，不能真实体现体内肠道微生物的组成和功能，尤其不能反映胃和小肠内的微生物的真实情况。考虑到肠道是动物消化吸收的主要场所并且含有重要的免疫系统，随着肠道微生物宏基因组学研究的发展，人体的肠道内容物样品(例如胃肠道疾病手术时获取的样品)或者养殖动物的肠道内容物样品等，必定将越来越多地作为肠道微生物宏基因组学的研究对象，从而更深入地揭示微生物与宿主健康的关系。

动物的肠道环境及其所含微生物具有复杂性，导致在微生物基因组DNA提取和纯化时面临着问题，需要开发适合肠道内容物的宏基因组DNA提取的完整流程方法，确保DNA能够成功提取并且真实准确地反应肠道微生物的种类和丰度。目前商用的相关提取试剂盒均仅针对粪便样品而设计。相比于粪便样品，小肠内容物的样品有如下特点：(1)微生物含量少，相同体积样品的微生物数量仅为粪便样品的0.1％-1％甚至更少；(2)小肠内容物中包含大量未消化的食物颗粒和碎片，这将影响微生物DNA的提取，导致食物DNA污染；(3)小肠上皮细胞更新速度快，成熟的上皮细胞最终在绒毛顶端凋亡和脱落，采集样品时机械外力也容易导致小肠绒毛损伤和细胞脱落，肠道内容物样品中存在宿主细胞和宿主DNA碎片，导致宿主DNA污染；(4)肠道内容物中有小肠消化液和多种杂质，容易引起DNA的降解或者容易抑制后续分子实验酶的反应活性。综上所述，直接使用粪便样品试剂盒的方法处理肠道内容物样品，尤其是小肠段的内容物样品，难以成功获得高质量的宏基因组的DNA。